豬瘟、豬藍(lán)耳病毒和沙門(mén)氏菌混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

于國(guó)偉，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種具有高度接觸性，急性，熱性，多數(shù)呈地方流行性的傳染病[1]。主要表現(xiàn)為仔豬呼吸困難、氣喘等呼吸系統(tǒng)癥狀和高致死率，主要傳播途徑為空氣和接觸等水平傳播，也可通過(guò)胎盤(pán)和交配等垂直傳播。豬瘟(CSF)又稱豬霍亂或爛腸瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性、急性或慢性、發(fā)熱性和致死性傳染病。其主要臨床表現(xiàn)為母豬發(fā)生繁殖障礙性疾病，不孕不育，流產(chǎn)，死胎等癥狀。該病不僅引起母豬繁殖障礙、新生仔豬先天感染以至死亡，還可引起免疫耐受并出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。目前，該病在包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲、非洲、拉丁美洲、歐洲東部等的養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)都有不同程度的發(fā)生與流行，給養(yǎng)豬業(yè)的繁育和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p害[2，3]。豬沙門(mén)氏菌病(swine salmonellosis)又名仔豬副傷寒(Piglet paratyphoid)，是由沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌引起的仔豬的一種傳染病，主要表現(xiàn)為敗血癥和壞死性腸炎，有時(shí)發(fā)生腦炎、腦膜炎、卡他性或干酪性肺炎[4]。該病在臨床上分為急性和慢性兩型，一般呈散發(fā)或地方性流行，一年四季均可發(fā)生，但以春、冬和潮濕多雨的秋季發(fā)生居多。2017年8月，實(shí)驗(yàn)室接診大慶市某豬場(chǎng)送檢病例，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確診為豬瘟、豬藍(lán)耳病毒和沙門(mén)氏菌的混合感染。現(xiàn)報(bào)告如下：

1 發(fā)病情況

黑龍江省大慶市某豬場(chǎng)存欄300頭豬，2017年8月該豬場(chǎng)仔豬突然發(fā)病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫升高至41～42 ℃，仔豬腹瀉排有黃色或灰綠色稀便，呼吸困難，偶有氣喘，體表皮膚發(fā)紺并有針狀出血點(diǎn)，精神萎靡，食欲廢絕，仔豬發(fā)病率約為45%，死亡率約為55%，病程為2～5 d。母豬食欲下降，精神沉郁，個(gè)別出現(xiàn)流產(chǎn)與死胎等癥狀。

2 剖檢變化

眼觀，病豬全身皮膚發(fā)紺，腹部及臀部發(fā)紫，耳尖發(fā)紫，眼結(jié)膜水腫，腿部和背部有針尖大小出血點(diǎn)，被毛粗亂無(wú)光澤，腹部有不規(guī)則的隆起丘疹。剖檢后，取出腹股溝淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)其腫大并充血，腸壁增厚充血并有潰瘍?cè)睿c系膜淋巴結(jié)腫大充血（見(jiàn)圖1），腹腔里肝臟水腫，脾臟腫大表面有出血點(diǎn)并伴有少量壞死灶（見(jiàn)圖2），回盲口處有扣狀腫。胸腔中肺臟明顯水腫且嚴(yán)重充血，肺膈葉有輕度卡他性炎癥（見(jiàn)圖3），通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理剖檢臟器變化初步懷疑為豬瘟、豬藍(lán)耳病毒和沙門(mén)氏菌混合感染，但還需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)確診。

圖1 腸壁增厚充血，腸系膜淋結(jié)腫大

圖2 脾臟水腫且有白色壞死灶

圖3 肺臟腫大充血

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

無(wú)菌采集病死豬的腸、肺臟用平板劃線法涂布于瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，形成灰白色菌落，挑取菌落于SS瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察到中間黑色外部透明的圓形菌落（見(jiàn)圖4），挑取其菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢時(shí)可見(jiàn)兩端鈍圓的陰性桿菌（見(jiàn)圖5）。

圖4 SS瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出中間黑色外周透明的菌落

圖5 兩端鈍圓的陰性桿菌（10x10）

3.2 生化鑒定

細(xì)菌純培養(yǎng)后，分別接種于硫化氫、苯丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甲基紅、尿素、賴氨酸、枸椽酸鹽、靛基質(zhì)、葡萄糖等生化培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生化反應(yīng)特性，結(jié)果為該菌株可使硫化氫變黑，能分解葡萄糖但產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能使鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸變紫但不能發(fā)酵尿素，符合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中沙門(mén)氏菌的特征，因此可判定該菌株為沙門(mén)氏菌（見(jiàn)表1）。

3.3 藥敏試驗(yàn)

挑取單菌落溶于生理鹽水中，然后均勻涂布于血瓊脂培養(yǎng)基中，貼上四環(huán)素、恩諾沙星、頭孢唑啉、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、克林霉素、林可霉素等藥敏片，37 ℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)測(cè)量抑菌環(huán)判斷其耐藥性，結(jié)果表明該細(xì)菌對(duì)恩諾沙星、慶大霉素和鏈霉素高度敏感；對(duì)卡那霉素、克林霉素中度敏感；對(duì)四環(huán)素、頭孢唑啉和林可霉素有較強(qiáng)的耐藥性（見(jiàn)表2）。

3.4 PCR檢測(cè)

用TIANamp Virus DNA/RNA Kit 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病料組織的DNA和RNA，用豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬藍(lán)耳病毒、豬鏈球菌、豬沙門(mén)氏菌、豬流行性腹瀉病毒等特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，這些特異性引物參照GenBank公布的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)而合成（見(jiàn)表3）。結(jié)果顯示第1泳道在599 bp左右處有一條條帶，與豬瘟病毒引物的目的片段大小相符；第2泳道在372 bp左右處有一條條帶，與豬藍(lán)耳病毒引物的目的片段大小相符；在第3泳道307 bp左右處有一條條帶，與豬沙門(mén)氏菌引物的目的片段相一致（見(jiàn)圖6）。再結(jié)合該病例的發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、剖檢后組織器官的病理變化以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室診斷可確診為該病例是由豬藍(lán)耳病毒、豬瘟和豬沙門(mén)氏菌的混合感染。

圖6 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 生化鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 引物列表

4 討論

結(jié)合發(fā)病情況、剖檢后組織器官的病理變化、臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室診斷等方面可確診大慶市某豬場(chǎng)送檢的病豬為豬藍(lán)耳、豬瘟病毒和豬沙門(mén)氏菌的混合感染。雖然該豬場(chǎng)已經(jīng)免疫接種過(guò)豬瘟及豬藍(lán)耳病疫苗，但體內(nèi)產(chǎn)生的抗體不足以抵抗病毒的侵襲，恰好大慶地區(qū)在8月初頻繁下雨導(dǎo)致空氣環(huán)境悶熱潮濕，在這種應(yīng)激條件的刺激下很容易使豬群發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，致使其免疫抵抗力降低從而繼發(fā)感染沙門(mén)氏菌。因此，應(yīng)盡量改善豬群的生活環(huán)境，并制定合理的免疫程序，避免引起豬群細(xì)菌性繼發(fā)感染。

1）目前，豬藍(lán)耳病毒和豬瘟病毒尚無(wú)特效藥可供治療，因此預(yù)防是關(guān)鍵。防治原則是盡力切斷或減少傳染源并提高敏感動(dòng)物的抗病能力，防止并發(fā)和繼發(fā)感染；嚴(yán)格控制生豬來(lái)源，避免外毒帶入；堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理， 搞好豬圈的清潔衛(wèi)生；減少飼養(yǎng)密度，保持良好通風(fēng)，做到冬暖夏涼；調(diào)整日糧，多添加富含維生素、礦物質(zhì)的飼料，以保持氨基酸平衡[5]。同時(shí)，該豬場(chǎng)可采取全進(jìn)全出方式，盡量避免不同豬群間的接觸在最大程度上降低感染。

2）目前，防治豬沙門(mén)氏菌病的疫苗種類較多，但最好使用當(dāng)?shù)鼗蛘弑救悍蛛x得到的菌株制成的單價(jià)滅活疫苗，具有最好的免疫效果，而一般的單價(jià)滅活苗和多價(jià)滅活疫苗效果較差[6]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)藥敏試驗(yàn)確定了慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星對(duì)該株沙門(mén)氏菌具有良好的滅菌抑制作用，建議采用以上藥物治療豬群。

3）定期用消毒水對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行噴霧消毒，降低環(huán)境中的細(xì)菌量。對(duì)病死豬要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)害化處理，而對(duì)病豬的排泄物及污染的飼料、飲水、用具、食槽和圈舍等，要用2%～4%火堿溶液或10%～20%石灰乳進(jìn)行徹底消毒[7]。同時(shí)對(duì)運(yùn)輸車(chē)輛也要做好消毒工作，防止外來(lái)病毒入侵。

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