高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物殘留

梁晶晶，徐瀟穎，丁宇琦，陳萬勤，劉 柱，羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052)

喹諾酮類藥物是一種具有4-喹諾酮共同基本母核的人工合成抗菌藥，可通過直接作用于細菌的核，抑制其DNA旋轉(zhuǎn)酶，破壞其代謝和繁殖，從而迅速殺滅細菌，具有抗菌譜廣、抗菌力強等優(yōu)點，被廣泛應用于動物和人類的多種感染性疾病的預防和治療[1]。但該類藥物對消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、骨骼等有一定毒性且易產(chǎn)生耐藥性[2-3]，如對動物長期使用，會造成動物性食品中喹諾酮藥物殘留，同時對食用者的健康造成危害。近年來，部分水產(chǎn)品養(yǎng)殖戶為提高產(chǎn)量，常在養(yǎng)殖過程中亂用、濫用此類藥物，以致水產(chǎn)品安全事件頻發(fā)。為確保消費者的安全，我國及歐盟等組織均對水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的使用情況及殘留限量做了嚴格規(guī)定。如我國規(guī)定牛、雞、豬、羊、兔等動物的肌肉、脂肪、肝、腎中達氟沙星、二氟沙星、 恩諾沙星(環(huán)丙沙星與恩諾沙星之和)、沙拉沙星等喹諾酮類獸藥的最高殘留限量為0.01～1.9 mg/kg[4]。

喹諾酮類藥物殘留問題已越來越引起人們的重視，其檢測方法主要有微生物法[5]、酶聯(lián)免疫法[6-7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-12]。但微生物法的檢測限過高，特異性不強；酶聯(lián)免疫法屬于半定量篩查方法，易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象；液相色譜法靈敏度低，抗干擾能力弱,定性效果差，且不適合多殘留同時分析。近年來，液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)由于兼具液相色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性特點，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段。但由于水產(chǎn)品基質(zhì)復雜，通常含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂，在樣品預處理過程中，采用沉淀和離心去除蛋白的同時，脂肪和磷脂也被共提取出?，F(xiàn)有的前處理方法通常采用正己烷脫脂、SPE固相萃取柱、離子交換柱或用其他反向吸附劑(如硅膠、C18等)從組織提取物中去除脂肪，以消除樣品基質(zhì)的干擾。但這些前處理方法普遍存在步驟繁瑣、測定時間長等缺點，且無法去除磷脂。

PRiME HLB是一種最新型的固相萃取柱，是基于“N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”填料的反相復合填料，對動物源性食品中的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等物質(zhì)具有特異性的吸附能力，且無需活化與平衡，樣品經(jīng)有機溶劑提取后，可直接上樣，操作極其簡便，不會出現(xiàn)堵柱情況。而目前常用的SPE凈化方式(HLB、WAX等)均需經(jīng)活化、平衡、上樣、淋洗和洗脫等多個步驟，操作繁瑣，費時費力。PRiME HLB采用最簡單的過濾式凈化方式，可將凈化速度提高40%，只需3個步驟即可完成整個樣品制備過程，操作簡單、省時快速，凈化后可以去除動物源性食品中蛋白、脂肪和磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。目前國內(nèi)外僅有少量將此技術(shù)應用于水產(chǎn)品中磺胺類和青霉素類藥物殘留檢測的報道[13-14]，但未見其用于水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測的相關(guān)報道。本研究以明蝦和鱸魚為研究對象，采用PRiME HLB樣品凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)為分析手段，同時測定水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物的殘留量。該方法簡便快速，易于操作，為水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的測定提供了新途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XevoTMTQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；氮氣吹干儀(Biotage公司)；渦旋混合器(上海琪特公司)；Multiduge X1臺式離心機(美國Thermo公司)；Ks 4000 Ic低溫搖床(德國IKA公司)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Fluka公司)；乙酸銨(質(zhì)譜純，美國Sigma公司)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)。

實驗所用19種獸藥的標準物質(zhì)均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，喹諾酮內(nèi)標混合液購自北京振翔科技有限公司。

1.2 標準溶液配制

1.2.1對照品儲備液分別精密稱取19種喹諾酮類藥物10 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈溶解并定容至20 mL，配成500 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃下存放。

1.2.2混合對照品中間液精密移取0.2 mL各對照品儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，精密移取1.0 mL至50 mL容量瓶中，用乙腈定容，即得200 μg/L的混合對照品中間液，于4 ℃下保存。

1.2.3同位素內(nèi)標儲備液直接購買10 mg/L的混合同位素內(nèi)標儲備液(諾氟沙星-D5、萘啶酸-D5、培氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、雙氟沙星-D3)。

1.2.4混合同位素內(nèi)標中間液精密移取0.1 mL混合同位素內(nèi)標儲備液，用乙腈定容至5.0 mL，即得200 μg/L的混合同位素內(nèi)標中間液，于4 ℃下避光保存。

1.2.5混合標準曲線的制備精密移取混合對照品中間溶液和混合同位素內(nèi)標中間液適量(標準工作溶液中內(nèi)標物濃度應與樣品待測液中一致)，用空白樣品基質(zhì)溶液配成0.2～20 μg/L的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理方法

準確稱取樣品2.0 g于50 mL離心管中，精確加入同位素內(nèi)標混合液0.2 mL。加入9.8 mL 80%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，振蕩30 min，再以20 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加至PRiME HLB 固相萃取柱，保持1滴/s的流速，待過完后加入2 mL提取液沖洗小柱，收集所有流出液于45 ℃下氮吹至小于0.7 mL，殘留液用純水定容至1.00 mL，過0.22 μm有機濾膜，待上機測試。

空白樣品基質(zhì)溶液的制備：取不含喹諾酮類藥物的空白樣品，除不加內(nèi)標工作液外，同上處理，制得空白樣品基質(zhì)溶液。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)(A)和甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～0.25 min，2%B；0.25～11.25 min，2%～100%B；11.25～13.00 min，100%B；13.00～13.10 min，100%～2%B；13.10～17.00 min，2%B。

1.4.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描模式；多反應監(jiān)測(MRM)模式；源電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h；19種待測化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測模式下19種藥物及內(nèi)標物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass conditions of 19 drugs and internal standard under MRM mode

*quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇柱效高、穩(wěn)定性好、保留能力強的Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)，比較了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相對19種待測物的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-水作為流動相時，分離度和靈敏度明顯優(yōu)于乙腈-水流動相。為進一步提高待測化合物的離子化效率，增加靈敏度，結(jié)合相關(guān)報道[15],在流動相中添加對正離子有增強作用的甲酸和乙酸銨，通過比較不同甲酸濃度和乙酸銨濃度對靈敏度及峰形的影響，最終確定流動相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；再優(yōu)化流動相比例，最終選擇線性梯度洗脫。 上述優(yōu)化條件下目標物分離度較好、保留時間適中。

通過一級質(zhì)譜掃描分析0.5 mg/L的19種喹諾酮標準溶液和同位素內(nèi)標液，得到各目標物的分子離子，并對分子離子進行裂解，得到二級碎片信息，優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，使各化合物的響應最大化。優(yōu)化后的質(zhì)譜監(jiān)測參數(shù)見表1。在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，混合標準溶液中各化合物的定量離子色譜圖見圖1。

圖1 混合標準樣品的定量離子色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of mixed standards

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

常用的抗生素提取溶劑有乙腈、乙腈-水、甲醇和甲醇-水等，水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂類等大分子物質(zhì)，采用甲醇或甲醇-水溶液提取，提取液較混濁，樣品凈化困難，且回收率偏低。乙腈具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，并且其帶出的弱極性成分少，質(zhì)譜響應高、基質(zhì)干擾小，因而選用乙腈作為主要提取溶劑。本實驗首先考察了60%乙腈水、70%乙腈水、80%乙腈水和90%乙腈水4種不同配比提取劑的提取效果，結(jié)果表明，用80%乙腈水作為提取劑時各化合物的回收率較高。分析原因，經(jīng)60%乙腈水和70%乙腈水提取后的提取液較混濁，基質(zhì)效應大，經(jīng)80%乙腈水和90%乙腈水提取后的提取液較澄清，蛋白基本沉淀，但90%乙腈水中乙腈比例過高，使蛋白質(zhì)快速凝結(jié)成團，而凝結(jié)的蛋白質(zhì)阻礙了提取液進入內(nèi)部發(fā)生作用，添加一定比例的水可起到分散作用。

由于喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基，具有酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶液，在有機溶劑中添加一定比例的酸或堿提取可顯著提高回收率[16-17]?？疾炝?0%乙腈水和80%乙腈水(含0.1%甲酸)2種提取劑對回收率的影響，結(jié)果顯示酸性提取劑可獲得更優(yōu)的回收率。因此，最終確定提取溶劑為80%乙腈水(含0.1%甲酸)。

2.3 離心條件的優(yōu)化

樣品經(jīng)提取劑提取后，需進行離心分離得到澄清的上清液，以便進行后續(xù)的凈化處理。本實驗對離心條件進行了考察。結(jié)果表明，經(jīng)普通離心機(<5 000 r/min)作用后，提取液仍渾濁，不利于凈化，隨著離心力的加大，提取液逐漸澄清，經(jīng)15 000～20 000 r/min離心分離后，上清液基本澄清，過PRiME HLB時較通暢。水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，低速離心只能分離普通的固體懸浮顆粒，而高速離心能夠加快液體中顆粒的沉降速度，高速分離懸浮介質(zhì)中較小的顆粒物質(zhì)，從而達到理想的分離效果。本研究確定的離心速率為20 000 r/min，離心時間為5 min。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

本實驗采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱對樣品進行凈化，考察了Oasis PRiME HLB(200 mg，6 mL)的柱容量，比較了不同上樣體積的樣品凈化程度。結(jié)果表明，上樣液中樣品量≤0.5 g時，基質(zhì)效應小，凈化效果明顯，而樣品量為0.5～1.0 g時，基質(zhì)效應逐漸增加，說明樣品量為0.5 g時該柱對雜質(zhì)的吸附能力接近飽和，過多的上樣體積會造成部分雜質(zhì)無法吸附，隨目標化合物共流出，導致凈化效果不理想。因此，本實驗確定上樣體積為2 mL(含0.4 g樣品量)。

2.5 線性關(guān)系、檢出限、定量下限與加標回收率

對陰性魚肉樣品和蝦肉樣品分別進行加標實驗，加標量為5、10、20 μg/kg，每個濃度設(shè)6個平行，分別計算回收率和相對標準偏差(RSD)，并根據(jù)信噪比，以及質(zhì)譜本身的穩(wěn)定性、不同儀器間的差異和方法的適用性，確定本方法的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2～3。結(jié)果表明，魚肉中各目標化合物的回收率為83.4%～119.9%，RSD為 2.6%～14.9%，檢出限為0.5 μg/kg；蝦肉中各目標化合物的回收率為72.1%～118.3%，RSD為2.4%～15.6%，檢出限為0.5 μg/kg。該方法具有良好的準確度和精密度，可以滿足水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的檢測要求。

表2 魚肉中喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和精密度Table 2 Linear equations,correlation coefficient(r),limit of detection,limit of quantitation，recovery and precision of quinolone antibacterials in fish

表3 蝦肉中喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和精密度Table 3 Linear equations,correlation coefficient(r) ,limit of detection,limit of quantitation，recovery and precision of quinolone antibacterials in shrimp meat

2.6 實際樣品的分析

采用本方法對30份市售水產(chǎn)品進行測定，結(jié)果在1批黑魚中檢出氧氟沙星(含量93.8 μg/kg)，1批黃鱔中檢出諾氟沙星(含量260 μg/kg)，陽性樣品的TIC色譜圖見圖2。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第2292號，我國將停止在食用性動物中使用氧氟沙星和諾氟沙星等獸藥，本結(jié)果說明在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中亂用獸藥現(xiàn)象依然嚴重，值得引起有關(guān)部門的重視。

3 結(jié) 論

本研究應用PRiME HLB凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。通過對水產(chǎn)品中的魚肉和蝦肉進行方法學評價，證明各組分在1～20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為72.1%～119.9%，RSD為2.4%～15.6%。本方法適用于水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測，具有準確、快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點。

[1] Li J S，Qiu Y M，Wang C.DrugResidueAnalysis.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press(李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析.上海：上?？茖W技術(shù)出版社),2002：256-299.

[2] Domagala J M.J.AntimicrobialChemotherapy，1994,33(4):685-706.

[3] Liu L J，Liu H，Liang M，Ma S Y.Med.Herald(劉麗娟，劉虹，梁敏，馬世堯.醫(yī)藥導報)，2005，24(10)：959-960.

[4] Maximum Residue Limit of Veterinary Drugs in Animal Food.Announcement No.235 of the Ministry of Agriculture(動物性食品中獸藥最高殘留限量.農(nóng)業(yè)部235號公告),2002.

[5] Ev Lda S，Schapoval E E.J.Pharm.Biomed.Anal.，2002，27(1/2)：91-96.

[6] Zheng J，Huang X R，Li Y P.FoodSci.(鄭晶，黃曉蓉，李耀平.食品科學)，2004，25(10)：247-250.

[7] Huet A C，Charlier C,Tittlemier S A,Singh G,Benrejeb S,Delahaut P.J.Agric.FoodChem.，2006,54(8):2822-2827.

[8] Zhao S J,Jiang H Y,Li X L,Mi T J,Li C,Shen J Z.J.Agric.FoodChem.，2007,55(10):3829-3834.

[9] Kirbis A，Marinsek J，F(xiàn)lajs V C.Biomed.Chromatogr.，2005,19(4):259-265.

[10] Samanidou V，Evaggelopoulou E，Trotzmuller M,Guo X H,Lankmayr E.J.Chromatogr.A，2008，1203(2)：115-123.

[11] Johnston L，Mackay L，Croft M.J.Chromatogr.A，2002，982：97-109.

[12] Ju L Y，Song X H，Gu J，Xu C G，Yang L J.J.Instrum.Anal.(鞠玲燕，宋曉華，谷婕，徐成鋼，楊麗君.分析測試學報)，2016，35(1)：42-47.

[13] Wang J，Zhang X Y，Hao J，Xu B W，Chen W B.FineandSpecialtyChemicals(王駿，張秀妍，郝佳，許炳雯，陳文博.精細與專用化學品)，2017,25(1):41-44.

[14] Guo M M，Li Z X，Wang Z，Pan M X，Wu H Y.J.Instrum.Anal.(郭萌萌，李兆新，王智，潘明軒，吳海燕.分析測試學報)，2017,36(3):337-342.

[15] Wan Y W，Deng K G，Liu L，Huang H W.ChineseJournalofVeterinaryScience(萬譯文，鄧克國，劉麗,黃華偉.中國獸醫(yī)學報)，2012,32(12):1886-1889.

[16] Cao J，Chen Y，Yang R Z，Huang Y F.ChineseJournalofVeterinaryDrug(曹軍，陳勇，楊瑞章,黃月芳.中國獸藥雜志)，2011，45(7):21-25.

[17] Li H F，Yin J G，Liu Y M.FisheryQualityandStandardinChina(李慧芳，殷軍港，劉永明.中國漁業(yè)質(zhì)量與標準)，2012,2(1):62-66.