基于Miseq測序初步分析興安落葉林外生菌根菌的生態(tài)分布

烏仁陶格斯，王 娟

（呼和浩特民族學院 環(huán)境工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

外生菌根是真菌的菌絲包被在植物幼嫩細根外形成的菌套和在細胞間形成哈帝氏網(wǎng)結(jié)構(gòu)與宿主植物細根形成的共生體[1-3].Miller（1982）統(tǒng)計結(jié)果顯示，世界上能形成外生菌根的真菌有約5000種[4].我國已經(jīng)報道的外生菌根菌約520種，隸屬于子囊菌和擔子菌2個亞門，41科77屬[5].外生菌根是在北方森林喬木樹種菌根中的主要類型，在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[6].

興安落葉松（Larix gmelinii）是寒溫帶森林主要建群種，也是重要的用材針葉樹種.內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)是我國最重要的國有林區(qū)之一，同時是我國北疆重要生態(tài)屏障.為加快改善森林生態(tài)環(huán)境，前人對大興安嶺森林植被與生物多樣性保護方面做了大量的工作，尤其是在外生菌根菌資源調(diào)查、生態(tài)功能研究方面取得了一定的成果[7].研究表明，落葉松林下土生大型真菌中外生菌根真菌占94.45%[8].樊永軍（2009）報道了與興安落葉松共生的外生菌根菌14種[9].本文運用Illumina MiSeq測序平臺，以大興安嶺落葉松為研究對象，初步調(diào)查分析大興安嶺興安落葉松外生菌根菌生態(tài)分布，為外生菌根菌生態(tài)分布與環(huán)境因子的互作規(guī)律研究提供參考.

1 研究區(qū)概況

內(nèi)蒙古大興安嶺國家級森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站位于內(nèi)蒙古大興安嶺北部根河林業(yè)局境內(nèi)，地理坐標為東經(jīng)121°30′～121°31′，北緯 50°49′～50°51′，海拔 800m～1100m.該區(qū)屬寒溫帶濕潤氣候區(qū).主要森林植被有興安落葉松（Larix gmelinii）為主，伴生種有白樺、山楊、杜鵑等.土壤類型為灰棕壤.

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

于2015年8月，在內(nèi)蒙古大興安嶺國家級森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站興安落葉松林地，在試驗區(qū)內(nèi)選定的5個樣地、每個樣地設3個采樣點，采集根際0cm～30cm深的土壤樣品，分別取10cm×10cm×10cm帶細根土樣裝入塑料袋中并編號，密封，并認真填寫好野外調(diào)查表（包括海拔、經(jīng)緯度等）.將土樣帶回實驗室，置于-20℃冰箱中保存.將每個樣地3個采樣點的土樣進行混合，此混合土壤樣品作為DNA提取的樣品，分別編號為 TX1、TX2、TX3、TX4、TX5.

2.2 實驗方法

土樣總DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA（具體DNA提取步驟按照說明書進行）.

基因組的PCR：

選用引物 真菌ITS檢測擴增引物ITS1和ITS4

PCR 反應體系 5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，F(xiàn)orward Primer(5μmol/L)0.8μL，Reverse Primer(5μmol/L)0.8μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng；補ddH2O至 20μL.

PCR反應程序 預變性95℃ 2min；循環(huán)95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，30 個循環(huán)；72℃延伸 5min.

PCR實驗鑒定 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，取2μL上樣量進行檢測.

測序與數(shù)據(jù)處理 將PCR產(chǎn)物利用Ilumina Miseq PE250進行測序.然后根據(jù)測序結(jié)果，整理、過濾原始數(shù)據(jù)，獲取優(yōu)質(zhì)序列，并進行對比和統(tǒng)計分析.

3 結(jié)果與分析

鑒定結(jié)果表明，興安落葉松采樣地外生菌根菌分屬于擔子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota 2個門，傘菌綱Agaricomycetes、節(jié)擔菌綱Wallemiomycetes、盤菌綱Pezizomycetes、圓盤菌綱Orbiliomycetes 4個綱，革菌目Thelephorales、傘菌目 Agaricales、牛肝菌 Boletales、蠟殼耳目Sebacinales、紅菇目 Russulales、阿太菌目 Atheliales、盤菌目Pezizales、圓盤菌目Orbiliales 8個目.其中傘菌目最多，優(yōu)勢菌目依次為傘菌目Agaricales、紅菇目Russulales、牛肝菌Boletales. 在科水平上，Thelephoraceae、Sebacinaceae、Pyronemataceae、Inocybaceae、Suillaceae、Cortinariaceae、Russulaceae、Atheliaceae分別占所選真菌總數(shù)的8.14%、5.17%、2.86%、2.73%、1.38%、1.03%、0.72%、0.55%（詳見表1）.

從興安落葉松5個樣地所采的土壤樣品測試分析結(jié)果來看（如表1和表2所示），優(yōu)勢菌屬主要為錦革菌屬Tomentella、絲膜菌屬 Cortinarius、紅菇屬 Russula、乳菇屬（Lactarius）、乳牛肝菌屬 Suillus.在每個采樣地（TX1、TX2、TX3、TX4和TX5）出現(xiàn)的外生菌根菌種數(shù)依次為34、32、28、26和39種，其中每個樣地均出現(xiàn)的外生菌根菌種有6種，如Russula versicolor、Russula citrinochlora、Lactarius vietus、Suillus paluster、Suillus spectabilis、Pseudotomentella tristis，TX5樣地出現(xiàn)的菌種最多.

表1 所采樣樣地興安落葉松主要外生菌根真菌科屬水平統(tǒng)計

表2 鑒定到種的興安落葉松外生菌根菌組成分析

續(xù)表

4 結(jié)論與討論

本文采用Illumina MiSeq測序技術(shù)，對興安落葉松外生菌根真菌進行了較全面的檢測.從結(jié)果分析可知，興安落葉松外生菌根菌類型較多，鑒定到2個門、4個綱、8個目.在科水平上，革菌科、蠟殼耳科、火絲菌科、絲蓋傘科、乳牛肝菌科、絲膜菌科、紅菇科所占比例較高.其中鑒定到種的共有53類型，如絲膜菌屬21種、紅菇屬13種、乳牛肝菌屬5種、棉革菌屬4種、乳菇屬4種、絲蓋傘屬3種、擬棉革菌屬1種、蠟殼耳目屬1種、地孔菌屬1種.從菌根共生關(guān)系來看，這些多種類型的外生菌根菌能夠幫助落葉松的生長及發(fā)育，提高它對不利環(huán)境的適應能力.

研究表明，在森林砍伐區(qū)內(nèi)地上和地下部分的不同外生菌根菌豐度有所區(qū)別[10].外生菌根真菌的分布與溫濕度林下光照、林齡以及撫育間伐等環(huán)境干擾因子有關(guān)[11].目前，外生菌根真菌分布的調(diào)查方法多樣，選擇不同的調(diào)查方法可能會影響研究結(jié)果.本研究利用Illumina Miseq測序平臺，18SrRNA基因擴增子技術(shù)成功地檢測了興安落葉松真菌多樣性，通過統(tǒng)計分析獲得了大量的、較全面的外生菌根真菌信息.本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在興安落葉松不同樣地土壤樣品中的出現(xiàn)的外生菌根菌種類型各不相同，且外生菌根菌鑒定結(jié)果與樊永軍（2009）[9]研究結(jié)果有所差異.說明，興安落葉松林下外生菌根真菌分布較廣，在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性中起到非常重要的作用，但由于所采用的調(diào)查方法、調(diào)查時間、選擇樣地的不同或環(huán)境干擾因子的影響等多種原因，引起其在土壤樣品中存在種類、數(shù)量的差異.

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