發酵雞血中優良菌株的篩選與鑒定

梁肖娜，葉青，吳尚，吳尚儀，關博元，康世墨，陶冬冰，岳喜慶，*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866）

雞血是雞肉屠宰加工過程中的主要副產物之一，約占雞質量的4%～9.7%。我國的雞血資源豐富，但是利用率較低，大部分雞血被作為廢棄物倒掉，只有少部分被加工成血豆腐、血腸等傳統食品或被加工成飼料、血粉等產品[1]。據調查研究顯示，畜禽類血液尤其是雞血營養價值較高，并且是一種含有營養價值較高的蛋白質來源，雞血的蛋白質含量高達16%～18%，其中含有18種氨基酸，有8種為人體生長所必需的氨基酸。此外，雞血中還含有豐富的維生素和生物酶類，以及豐富的氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦物質，其營養價值豐富、全面[2]。

由于目前在我國雞血資源較少的被得到開發和利用，大部分的雞血倒入到田地中被自然發酵，導致大量的雞血資源的流失，這不僅對我國現有的資源造成巨大的浪費，同時也給雞血資源充分開發和利用到其他方面造成不良的影響和效果[3-4]。本實驗從微生物學角度出發，并結合生產實際，以新鮮的雞血為原料，進行常溫下自然發酵，利用微生物培養和發酵技術，從霉變的雞血中分離篩選出優勢的有益微生物菌株[5]，并且對菌株進行鑒定研究，利用優勢菌株發酵雞血液體肥料，后期對雞血液體肥料的肥效進行研究。這不僅對于雞血資源的開發利用做出了一定的貢獻，并且也為雞血資源更好地應用于食品、飼料、肥料等方面奠定了堅實的理論基礎，同時也為其他動物血液的生產應用提供了潛在的科研價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血（自然條件下微生物狀態）：沈陽市偉峰肉雞加工廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、蔗糖、七水硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵：國藥集團化學試劑有限公司；DNA提取試劑盒、蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、10×PCRbuffer、r-Taq 酶、Loadingbuffer、MarkerDM2000、Gel-red核酸染料、引物：北京鼎國昌盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：鄭州南北儀器設備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱：太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BPS-250培養箱：上海梅穎浦儀表制造有限公司；BL-500電子天平：上海亞津電子科技有限公司；OLYMPUS CX21顯微鏡：上海優浦科學儀器有限公司；722G可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；PCR擴增儀、凝膠成像系統：美國伯樂公司；TDL-SA離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 培養基

肉膏蛋白胨培養基；孟加拉紅瓊脂培養基；馬鈴薯（PDA）培養基；改良察式培養基；干酪素培養基。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種初步分離與篩選[6-7]

將新鮮雞血置于無菌狀態下，室溫自然發酵30 d，采用10倍梯度稀釋法將霉變雞血分別涂布于細菌、霉菌分離培養基平板上（細菌37℃下培養、霉菌30℃下培養），待長出菌落后，分別從中挑取生長旺盛的單個菌株，進行反復分離純化至第三代，最終得到純種菌株并保存備用。再挑取上述純種菌株中生長旺盛的單個菌株，分別接種到以2%的雞血代替硝酸鈉作為唯一氮源的改良察式培養基平板上，在適宜溫度條件下培養，并反復分離純化直至得到純種菌株，初步觀察菌落形態并分類。將細菌和霉菌分別編為A、B兩組，將上述獲得純種菌株接種到干酪素培養基平板上，分別培養至30 h、60 h，并測量其透明圈直徑和菌落直徑的比值（DC），根據水解透明圈與菌落直徑的比值（DC）的大小可以初步判斷菌株蛋白酶活力的大小，最終分離純化在30 h、60 h時DC值較大的菌株，并且在0℃冰箱中保存備用。

1.4.2 菌種發酵復篩選[8]

經透明圈初篩后得到的細菌、霉菌菌株，各取一接種環量接種到滅菌的雞血中，在160 r/min條件下，搖床培養180 h（細菌37℃、霉菌30℃），測定蛋白質含量、可溶性蛋白質含量、氨基酸態氮含量，比較分析測定指標，篩選出發酵雞血的優勢菌株[9]。

1.4.3 菌株形態初步觀察與鑒定

觀察菌落的形狀、顏色、透明度等各項形態特征，細菌和霉菌分別通過革蘭氏染色、小室培養法在顯微鏡下進行觀察，并對照《伯杰細菌鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》，進行初步鑒定菌屬。

1.4.4 菌株DNA的提取和濃度測定

將四種菌株搖床培養至對數期，11 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加無菌生理鹽水進行重懸，反復吹打液體，重復3次以上操作，并收集菌液。試驗采用單菌落裂解法制備模板DNA，每個菌株提取3次，用微量紫外-分光光度計測定DNA質量濃度和在A260nm/A280nm下的光度值，光度值可以表示所提取DNA的純度，在Nucleic Acid的檢測良好的狀態下，用滅菌的蒸餾水進行多次零點校正，校正之后開始測定樣品DNA的濃度，每次進樣量為2 μL。將A260nm/A280nm在1.8～2.0范圍內的DNA樣品進行PCR擴增[10]。

1.4.5 菌株PCR擴增

1.4.5.1 細菌DNA的擴增[11]

試驗以提取細菌的DNA為模板，細菌的16SrDNA采用PCR進行擴增，擴增片段約為1 500 bp，上游引物為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物為 1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 擴增體系（50 μL）為：1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反應參數為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35個循環。反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，在1 500 bp處有清晰條帶后方可送出去檢測，測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.5.2 真菌DNA的擴增[12]

試驗以提取霉菌的DNA為模板，霉菌的28SrDNA采用PCR進行擴增，擴增片段約為600bp，上游引物為 ITS1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；下游引 物 為 IS4：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′），PCR 擴增體系（50 μL）為，1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反應參數為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35個循環。反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，在600 bp處有清晰條帶后方可送出去檢測，測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.6 細菌和真菌同源性分析及系統發育樹的構建

通過連接互聯網，將所檢測到的序列提交到NCBI（美國國立生物技術中心）數據庫，利用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）分析工具，將所分離得到的細菌的16SrDNA序列和霉菌28SrDNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中已建立的16SrDNA序列和28SrDNA進行相似性的比較分析，找到與已知目的基因序列同源性最高的已知菌種，再從GenBank/EMBL/DDBJ的數據庫中，提取數據庫中已知的標準菌株的基因序列和分離菌株的序列，用ClustalX2.1軟件進行校準排齊，用MEGA5.0軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從細菌、霉菌平板培養基分別獲得細菌60株和霉菌30株，經過反復分離純化后，保存備用。將上述獲得共90株菌株，分別挑一接種環，接種到以2%雞血為唯一氮源平板培養基上培養，獲得生長旺盛的細菌32株，霉菌生長旺盛的菌株18株，再將其接種到干酪素平板培養基上，獲得有生長透明圈的細菌15株，霉菌8株，分別培養至30、60 h測定其透明圈直徑和菌落直徑，計算兩者比值（DC值），各菌株在30、60 h生長以及透明圈大小情況如表1所示。

如表1所示，細菌和霉菌在30、60 h的透明圈直徑和菌落直徑以及透明圈直徑和菌落直徑比值（DC）可以看出，細菌A5、A7、A8菌株的產蛋白酶能力較強，DC值均在2以上；霉菌B1、B3、B4菌株的產蛋白酶能力較強，DC值均在1.5以上。

2.2 優勢菌株的復篩選

雞血中蛋白質含量的測定如圖1所示。

表1 培養30、60 h后各菌株生長以及透明圈大小Table 1 The growth of strains 30、60 h and size of transparency

圖1 雞血中蛋白質含量的測定Fig.1 Determination of protein content in chicken blood

如圖1所示用菌株發酵后雞血的蛋白質含量與對照組相比，兩組間數據差異非常顯著（P≤0.01），說明優勢菌株的添加可以顯著增加雞血中蛋白質的含量，細菌A5與A7、A8之間相比差異非常顯著（P≤0.01），而細菌A7與A8相比，沒有統計學顯著性差異（P＞0.05）；霉菌B1與B4之間相比有顯著性差異（P≤0.05），B3與B4相比存在統計學差異（P≤0.05），B1與B3相比差異不顯著（P＞0.05）。

雞血中可溶性蛋白質含量的測定如圖2所示。

圖2 雞血中可溶性蛋白質含量的測定Fig.2 Determination of soluble protein content in chicken blood

如圖2所示，發酵后雞血的可溶性蛋白質含量與對照組相比，兩組間數據差異極顯著（P≤0.01），說明添加優勢菌株可以使雞血中可溶性蛋白質的含量上升，細菌A5與A7、A8之間相比數據統計學存在顯著性差異（P≤0.01），A7、A8 差異不顯著（P＞0.05），霉菌B1、B3和B4之間差異極顯著（P≤0.01）。

雞血中氨基酸態氮含量的測定如圖3所示。

圖3 雞血中氨基酸態氮含量的測定Fig.3 Determination of amino acid nitrogen content in chicken blood

如圖3所示，發酵后的雞血和發酵前雞血中氨基酸態氮含量相比較，兩組數據之間存在統計學顯著性差異（P≤0.01），其中 A5與 A7差異不顯著（P＞0.05）與A8之間差異顯著（P≤0.05），而 A7、A8之間存在顯著性差異（P≤0.05）；霉菌 B1、B3、B4之間差異極顯著（P≤0.01）。綜合以上分析比較可以得出，細菌A7、A8和霉菌B1、B4為雞血發酵的優勢菌株。

2.3 優勢菌株菌落形態觀察

菌落形態學特征主要包括菌落形狀、菌落顏色、菌落透明度菌落質地等，細菌A7、A8經革蘭氏染色、過氧化氫和V.P.試驗均為陽性，菌株在平板上的單菌落呈現乳白色，圓形，邊緣整齊光滑，稍微透明，菌落直徑約為1 cm，負染色并在顯微鏡下觀察（圖4中A7、A8），均為粗壯的短桿狀，周生鞭毛，根據《伯杰細菌鑒定手冊》和顯微鏡觀察，初步判斷A7、A8為巨型桿菌。霉菌采用小室培養法進行培養觀察，霉菌B1為灰綠色，表面光滑，其菌落呈現大而疏松的棉絮狀，在顯微鏡下觀察產生假菌絲（圖4中B1），形成子囊和子囊孢子，分生孢子為球形；霉菌B4質地絲絨狀或稍帶絮狀，菌落反面略帶黃色，表面平坦，在邊緣有時具白色的菌絲體，在顯微鏡下觀察分生孢子球形或近球形（圖4中B4），依據《中國真菌雜志》、《真菌鑒定手冊》，初步判定B1、B4分別為青霉和曲霉。

圖4 細菌和霉菌顯微鏡圖片Fig.4 Microscopic pictures of bacteria and fungi

2.4 菌株DNA濃度檢測和提取結果

如表2所示，細菌A7、A8，霉菌B1、B4的DNA質量濃度均保持在30 ng/μL以上，并且4種菌株A260nm/A280nm下的光度值，也都均保持在1.8～2.0之間的范圍內，因此可進行PCR擴增。

表2 4種菌株DNA濃度和純度結果Table 2 Results DNA concentration and purity of four strains

2.5 PCR擴增結果

試驗分別以兩株細菌和真菌的DNA作為模板，在PCR擴增儀上進行PCR擴增反應，反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增的片段。細菌和霉菌所擴增的片段長度分別在 1 500 bp（5a）和 600 bp（5b），說明 PCR 擴增成功，可以進行序列測定。

2.6 細菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列同源性分析和系統發育樹構建

細菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析結果如表3所示。

由表3可知，本實驗篩選出的兩株細菌和霉菌與標準菌株的同源性均達到97%以上，其中A7與標準菌株的同源性達到了100%，因此基本可以確定A7屬于芽孢桿菌菌屬（Bacillus）；另外有兩株菌株與標準菌株的同源性達到了99%，基本可以確定這兩株屬于青霉菌屬（Penicillium）和曲霉菌屬（Aspergillus），分別是B1和B4；A8與標準菌株的同源性達到了97%，基本可以確定A8是屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）。

圖5 細菌和真菌PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of DNA extracted from the bacteria and mould strains

圖6為細菌根據16SrDNA，霉菌根據28SrDNA所建立的系統發育樹。

表3 細菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析結果Table 3 Homological analysis of bacteria and mould by 16Sr DNA and 28Sr DNA sequence

從圖中可以看出，A7屬于芽孢桿菌菌屬，被鑒定為 Bacillus thuringiensis；B1、B4 屬于霉菌菌屬，B1 被鑒定為Penicillium citreonigrum，B4被鑒定為Aspergillus tubingensis；A8屬于希瓦氏菌屬，被鑒定為Shewanella sp.。本實驗采用生理生化對該4種菌株進行初步鑒定，并結合上述對于細菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列鑒定和同源性分析比對，這與表3中的同源性分析比對結果是一致的，因此可以判斷細菌A7、A8分別為蘇云金芽孢桿菌和希瓦氏菌；霉菌B1、B4分別為青霉菌屬、塔賓曲霉。

圖6 細菌16SrDNA（a）和霉菌28SrDNA（b）建立的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacteria and mould established on the basis of 26SrDNA and 28Sr DNA sequence analysis

3 結論

本實驗利用現代化的微生物技術對自然發酵雞血進行微生物的培養、分離、純化，成功地篩選出細菌60株、霉菌30株，再經過透明圈試驗、蛋白質含量、氨基酸態氮含量、可溶性蛋白質含量篩選指標對90株菌株進行綜合比較分析，最終篩選出一組發酵雞血的優勢菌株為細菌A7、A8，霉菌B1、B4，并通過形態學鑒定、顯微鏡觀察以及16SrDNA和28SrDNA對優勢菌株進行分子鑒定，經同源性分析比對，最終得出細菌A7屬于芽孢桿菌菌屬，被鑒定為Bacillus thuringiensis，A8是屬于希瓦氏菌屬，被鑒定為Shewanella sp.；霉菌B1、B4屬于霉菌菌屬，B1被鑒定為Penicillium citre－onigrum，B4被鑒定為Aspergillus tubingensis。隨著人們生活水平的提高，對畜產品的需求量急劇增加，與此同時，國家和社會對于環境的要求也隨之提高，而養殖場的廢棄物的循環加工和再利用，也成為近年來研究的熱門話題之一。本實驗的研究和開展將會對提高雞血的綜合利用價值和后續的開發利用提供充分的理論依據和奠定堅實的基礎。

[1]王文婷,侯成立,宋璇,等.動物血漿蛋白水解物功能及應用研究進展[J].食品科學,2017(7):309-314

[2]楊葆春,靳義超,李全,等.動物血液資源的開發利用研究進展[J].青海畜牧獸醫雜志,2011(5):44-46

[3]GREENBERG J A,DIMENNA M,HANELT B,et al.Analysis of postblood meal flight distances in mosquitoes utilizing zoo animal blood meals[J].Journal of Vector Ecology,2012,37：83-89

[4]VUDATHALA D,CUMMINGS M,MURPHY L.Analysis of Multiple Anticoagulant Rodenticides in Animal Blood and Liver Tissue Using Principles of QuEChERS Method[J].Journal of Analytical Toxicology,2010,34：273-279

[5]趙曉丹,郭春華,柏雪,等.微生物發酵牛血生產蛋白飼料的研究[J].生物學通報,2016(4):45-49

[6]劉仲敏,何伯安,曹友聲,等.豬、牛血固態發酵生產蛋白質飼料的研究[J].微生物學通報,1995(6):351-354

[7]DONG M,JIANG X,JIANG H,et al.Studies on screening,identification and fermentation characteristics of new natto-producing strain with the strong fibrinolytic activity[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2001,24(1):95-98

[8]魯云風,楊柯金,梁子安,等.響應面分析法優化菌株B10發酵牛血條件的研究[J].飼料廣角,2010(21):29-31,40

[9]MISSOTTEN J A M,GORIS J,MICHIELS J,et al Screening of isolated lactic acid bacteria as potential beneficial strains for fermented liquid pig feed production[J].Animal Feed Science&Technology,2009,150：122-138

[10]武俊瑞,岳喜慶,石璞,等.PCR-DGGE分析東北自然發酵酸菜中乳酸菌多樣性[J].食品與生物技術學報,2014,33(2):127-130

[11]孫慧君,張穎,王洪玉,等.傳統發酵錦州小菜中主要微生物多樣性分析[J].食品科學,2017(2):15-19

[12]孟令帥,張穎,鄒婷婷,等.辣白菜中乳酸菌的分離鑒定[J].食品科學,2015(11):130-133