桑葚果酒酵母菌的篩選及其發(fā)酵性能研究

曹培杰，馬劍，崔晉，馬艷弘

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030901；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014）

桑葚又叫桑子、桑棗、桑果，?？坡淙~喬木桑樹(shù)的果實(shí)。桑葚果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)成分及黃酮類化合物，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，桑葚能補(bǔ)益肝腎、黑發(fā)明目、養(yǎng)血生津，具有多種保健功能；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑葚具有增強(qiáng)人體免疫力、促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)、防止人體動(dòng)脈硬化、骨骼關(guān)節(jié)硬化以及促進(jìn)新陳代謝等生理功效，被醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“二十一世紀(jì)的最佳保健果品”[1-3]。

由于桑葚是季節(jié)性水果，在常溫下易出現(xiàn)腐爛、變色、變味等情況，不宜儲(chǔ)藏運(yùn)輸，保質(zhì)期短，所以將桑葚果實(shí)加工成便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏的其他產(chǎn)品，對(duì)于提高桑葚的利用價(jià)值具有重要作用。目前以桑葚為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品種類較少，主要集中在桑葚汁、桑葚酒、蜜餞、罐頭、果醬、天然花色苷等產(chǎn)品[4-6]。其中利用桑葚釀造果酒，既有利于保持桑葚鮮果中的天然營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物又能夠增強(qiáng)桑葚酒的保健功能，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和市場(chǎng)潛力[7]。桑葚酒的品質(zhì)在很大程度上與所用酵母菌的發(fā)酵特性密切相關(guān)，然而目前為止，市場(chǎng)上大部分果酒的釀酒均采用的是葡萄酒釀酒酵母[8]，適宜桑葚酒釀造的專業(yè)酵母菌尚未見(jiàn)報(bào)道[9-11]。因此，本研究篩選適宜桑葚酒釀造的專用酵母菌株，并進(jìn)一步研究其發(fā)酵特性，對(duì)于提升桑葚酒品質(zhì)，促進(jìn)桑葚產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有一定的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物實(shí)驗(yàn)室自行分離的桑葚酵母菌株，分別為SG1-1、SG1-2、SG1-3、SG1-4、SG1-5、SG 2-1、SG 2-2、SG 2-3、SG 2-4、SG 3-1、SG 3-2、SG 3-3，共 12 株。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；取50 g固體粉末狀YPD培養(yǎng)基，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.5左右，115℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。

1.1.3 試劑

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；偏重亞硫酸鉀：北京君悅誠(chéng)品科貿(mào)有限公司；以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺(tái)：上海杰兔工貿(mào)有限公司；Blue-pard生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Five Easy Plus試驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；ML204電子天平：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHENAN滅菌鍋：上海宜川上嶺儀器有限公司；歐諾華榨汁機(jī)：美國(guó)伊斯曼公司；WYT糖度計(jì)：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；THZ-C-1全溫振蕩器：太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠；LXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離

取-20℃保存的菌種[12]，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min的搖床培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將菌種活化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，備用。

1.2.2 酵母菌的篩選

酵母菌的初篩：將活化的菌種按8%的接種量接入到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，采用杜氏小管發(fā)酵法[13]觀察各菌株的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率，初步獲得產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的菌株。

酵母菌的復(fù)篩：耐糖、酒精、SO2、及耐酸性篩選。將得到的產(chǎn)氣性較強(qiáng)的菌株分別接入到糖度為14，18，21，24，27°Bx，酒精濃度為8%、10%、12%、14%、16%、18%，SO2含量為 60、80、100、120、140 mg/L，pH 值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 的 YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，48 h后分別觀察杜氏小管的產(chǎn)氣情況。進(jìn)一步篩選出對(duì)糖度、酒精度、SO2、酸性耐受性較強(qiáng)的菌株。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵性能的測(cè)定

1.2.3.1 酵母菌最適溫度測(cè)定

將篩選得到的SG3-2酵母種子液按8%接種量接種于 21 °Bx的桑葚汁中，分別于 20、23、25、28、30、33、35℃條件下培養(yǎng)5 d，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的OD值，依據(jù)OD值的大小確定其最適溫度。

1.2.3.2 酵母菌耐酸能力的測(cè)定

將篩選出的SG3-2酵母種子液分別接種于pH值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的桑葚汁（21 °Bx）中，28 ℃的恒溫培養(yǎng)5 d，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度的大小判斷SG 3-2菌株的耐酸性能。

1.2.3.3 酵母菌耐酒精能力的測(cè)定

將篩選得到的SG3-2酵母種子液按8%的接種量分別接種于含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（8%、10%、12%、14%、16%、18%）的桑甚汁（21°Bx）中，28℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.2.3.4 酵母菌耐SO2能力的測(cè)定

21°Bx的桑葚汁中加入偏重亞硫酸鉀，使SO2濃度分別為 60、80、100、120 、140、160 mg/L，接入 SG3-2酵母菌種子液，28℃條件下培養(yǎng)5 d，600 nm處測(cè)其吸光度，依據(jù)OD值大小確定其對(duì)SO2的耐受能力。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取裝有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶1個(gè)，不接種酵母菌，作為空白對(duì)照。

將菌種SG3-2接種于滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔4 h取樣，在560 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種的篩選

2.1.1 酵母菌產(chǎn)氣性能的比較

分離的酵母菌株采用杜氏管發(fā)酵法，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h時(shí)，有少量氣體產(chǎn)生，而48 h后大多數(shù)菌株都有大量氣體產(chǎn)生，其中7株酵母菌株產(chǎn)氣量約等于杜氏小管的體積，分別為SG1-4、SG1-5、SG2-3、SG2-4、SG3-1、SG3-2、SG3-3，說(shuō)明這些菌株發(fā)酵能力旺盛，酵母菌株的產(chǎn)氣情況見(jiàn)表1。

表1 酵母菌株的產(chǎn)氣情況Table 1 Gas-producing conditions of yeast strains

2.1.2 酵母菌耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

在不同酸度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌，可以篩選出耐高酸性的菌株見(jiàn)表2。由表2可以看出，在產(chǎn)氣性良好的7株菌株中，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，所有菌株都不能生長(zhǎng)，而pH值等于2.5時(shí)，有5株能產(chǎn)生大量氣泡，分別為 SG1-4、SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，說(shuō)明這5株菌株耐酸性較強(qiáng)，在高酸性環(huán)境中仍能正常生長(zhǎng)。當(dāng)pH值大于3.0時(shí)，所有菌株均有大量氣泡產(chǎn)生。

表2 酵母菌耐酸性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test result of acid-resistance of yeasts

2.1.3 菌株對(duì)糖度的耐受性試驗(yàn)

在不同糖度的培養(yǎng)基中，菌株的生長(zhǎng)情況也有所不同見(jiàn)表3。由表3可以看出，當(dāng)糖度小于18°Bx時(shí)，所篩選出的5株耐酸性較強(qiáng)的菌株均有大量氣泡產(chǎn)生，而糖度大于21°Bx時(shí)，則其中有4株菌株生長(zhǎng)良好，有大量氣泡產(chǎn)生，分別為SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，將這4株菌株作為耐SO2能力測(cè)試的出發(fā)菌株。

表3 酵母菌對(duì)糖度的耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of glucose-tolerance of yeasts

2.1.4 酵母菌耐SO2性能的比較

在培養(yǎng)基中添加偏重亞硫酸鉀，可篩選出能耐高濃度SO2的菌株見(jiàn)表4。如表4，在酵母菌耐SO2試驗(yàn)中得到的4株出發(fā)菌株在SO2濃度小于100mg/L時(shí)，杜氏小管中均有大量氣泡產(chǎn)生，當(dāng)SO2濃度達(dá)到120 mg/L時(shí)，有一株菌株無(wú)氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明其不能耐受較高濃度的SO2，而其他3株均可以耐受140 mg/L的SO2且產(chǎn)生大量氣泡，其編號(hào)分別為SG1-5、SG3-2、SG3-3。

表4 酵母菌耐SO2性能試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of yeasts tolerance to SO2

2.1.5 酵母菌的耐酒精能力篩選

根據(jù)以上試驗(yàn)所篩選出的3株優(yōu)良菌種，進(jìn)行不同乙醇濃度的耐受性試驗(yàn)見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，乙醇濃度小于12%時(shí)，3株菌株均能正常生長(zhǎng)，當(dāng)乙醇濃度為14%時(shí)，其中有兩株（編號(hào)為SG1-5和SG3-2）菌株有氣體產(chǎn)生，當(dāng)濃度達(dá)到16%時(shí)，僅有1株能正常生長(zhǎng)，編號(hào)為SG3-2。通過(guò)以上試驗(yàn)，所篩選出的SG3-2菌株產(chǎn)氣性能好，耐酸性，耐SO2，耐乙醇能力較強(qiáng)，可作為桑葚果酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母。

表5 菌株的耐酒精測(cè)定結(jié)果TabIe 5 Determination results of alcohol-tolerance of strains

2.2 酵母菌發(fā)酵能力的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 酵母菌的最適溫度

酵母菌對(duì)溫度的耐受性試驗(yàn)見(jiàn)表6。由表6可以看出，SG3-2酵母菌在不同的溫度條件下，其菌懸液的OD值不同，說(shuō)明各發(fā)酵液中菌體濃度不同。當(dāng)溫度從20℃不斷升高時(shí)，發(fā)酵液的OD值也不斷增大，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，其OD值達(dá)到最大，當(dāng)溫度再升高時(shí)，菌懸液的OD值有所下降，說(shuō)明酵母菌的死亡速率大于新生速率。SG3-2最適生長(zhǎng)溫度為30℃，但在果酒發(fā)酵過(guò)程中，若溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致酒體風(fēng)味變差，所以在實(shí)際發(fā)酵時(shí)，其發(fā)酵溫度應(yīng)低于30℃。

表6 酵母菌對(duì)溫度的耐受性試驗(yàn)Table 6 The tolerance test of yeast to temperatures

2.2.2 酵母菌耐酸能力的測(cè)定

酵母菌耐酸性試驗(yàn)見(jiàn)表7。由表7可以看出，SG3-2酵母菌在pH值為2.0～7.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，且隨著pH值的逐漸增大，其OD值也逐漸變大，當(dāng)pH值達(dá)到4.0時(shí)，OD值達(dá)到最大，pH值繼續(xù)增加，其OD值減小。說(shuō)明pH值為4.0時(shí)，菌體濃度最大，酵母菌生長(zhǎng)最為旺盛，低酸性環(huán)境不適合酵母菌SG3-2的生長(zhǎng)，所以其最適pH值為4.0左右。

表7 酵母菌耐酸性試驗(yàn)Table 7 The test of acid-resistance of yeast

2.2.3 酵母菌耐酒精能力的測(cè)定

在不同乙醇濃度的的培養(yǎng)基中，酵母菌的生長(zhǎng)情況不同見(jiàn)表8。當(dāng)乙醇濃度由8%到14%逐漸增大時(shí)，培養(yǎng)液的OD值逐漸增大，乙醇濃度為14%，OD值最大，酵母菌生長(zhǎng)速率最快，最適合果酒發(fā)酵，當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí)，其OD值逐漸變小，說(shuō)明較高濃度的乙醇則會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)。

表8 酵母菌的耐酒精能力Table 8 The alcohol-resistance of yeasts

2.2.4 酵母菌耐SO2能力測(cè)定

在發(fā)酵前往桑葚汁中加入SO2，不僅可抑制雜菌的生長(zhǎng)，還可以防止色素被氧化。因此，具有較強(qiáng)的SO2耐受性的釀酒酵母有利于優(yōu)質(zhì)桑葚酒的釀造，酵母菌的耐SO2能力見(jiàn)表9。通過(guò)表9可以發(fā)現(xiàn)，隨著SO2濃度的增加，發(fā)酵液的OD值逐漸減小。當(dāng)SO2濃度為100 mg/L時(shí)，OD值減小了25%，當(dāng)SO2濃度為120 mg/L時(shí)，OD值減小了42%，說(shuō)明SO2濃度較高，對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)抑制作用越大。因此最適的SO2濃度為 100 mg/L～120 mg/L。

表9 酵母菌的耐SO2能力Table 9 The resistance to SO2of the yeasts

2.3 酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果

酵母菌SG3-2的生長(zhǎng)曲線如圖1。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，培養(yǎng)液的吸光度逐漸增大。SG3-2生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期為4 h～16 h，穩(wěn)定期是16 h～28 h，在此期間，菌株活力最強(qiáng)，生長(zhǎng)最為旺盛。在28h時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，是菌株取樣的最佳時(shí)期。28 h后進(jìn)入衰退期。菌株SG3-2的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期都較長(zhǎng)，有利于產(chǎn)生代謝物質(zhì)和發(fā)酵果酒，因此可作為桑葚果酒釀造的優(yōu)良酵母。

圖1 菌株3-2的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growh curve of the yeast SG3-2

3 結(jié)論

不同酵母菌種的發(fā)酵能力，產(chǎn)酒精能力和對(duì)發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)性不同，所得到的果酒的風(fēng)味和質(zhì)量也不同。優(yōu)良的菌株不僅發(fā)酵速度快，發(fā)酵能力強(qiáng)，而且可以產(chǎn)生良好的酒香和果香味。從桑葚中分離得到的12株酵母菌株，通過(guò)杜氏管發(fā)酵法和吸光光度法，可得到一株耐酸性，耐SO2及耐酒精能力強(qiáng)的菌株，該菌株在pH值為4.0～4.5，SO2濃度為100 mg/L，酒精濃度為14%的條件下，仍然能夠正常生長(zhǎng)，而且在生長(zhǎng)到28 h時(shí)，生長(zhǎng)最為旺盛。

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