小麥苗葉綠素在食品加工因素中的穩(wěn)定性分析

張琛 ，孫豐婷，胡艦，許慧卿，*

（1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225127；2.江蘇中譜檢測有限公司，江蘇南京210061）

小麥苗為禾本科植物小麥的嫩莖，在中醫(yī)里有清熱解毒、消炎、去臭、促進傷口愈合、抗氧化、預(yù)防腫瘤等生理作用，食用安全性極高[1-3]。此外，小麥苗含有豐富的葉綠素，其葉綠素原液在食品中常被做天然著色劑。但是，在實際生產(chǎn)加工中小麥苗葉綠素的含量和性質(zhì)常常受到加工條件的影響而發(fā)生變化。目前，對于葉綠素護綠的研究，主要是通過將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的銅鹽、鋅鹽等，但這些方法只考慮對產(chǎn)品穩(wěn)定性的增益，沒有考慮銅、鋅等離子作為人體必需微量元素其添加量對人體的影響[2-4]。本研究擬通過對小麥苗葉綠素在食品加工中穩(wěn)定性的分析，為小麥苗葉綠素原液在生產(chǎn)實踐中的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：新鮮小麥幼苗（六葉期）采自揚州市汊河鎮(zhèn)。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHB-IV雙A型雙面循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FA1004B型電子天平、722N型可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、亞硫酸鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；30%的雙氧水：西隴化工股份有限公司；氯化鐵、氯化亞鐵：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸、蔗糖、谷氨酸鈉：天津大茂化學(xué)試劑廠；加碘鹽：江蘇金橋制鹽有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小麥苗葉綠素提取液制備

取新鮮干凈的麥苗葉片7 g，加入少量碳酸鈣，并研磨，同時滴加數(shù)滴90%乙醇；勻漿后轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶中，加90%的乙醇溶液140 mL，超聲波破碎處理30 min，處理溫度為50℃，超聲波功率400 W[5-6]。靜置冷卻，減壓抽濾，得到葉綠素提取液，保存于棕色密封瓶中。

1.2.2 小麥苗葉綠素穩(wěn)定性試驗

對葉綠素粗提液分裝：取提取液2 mL加水稀釋5倍，得葉綠素稀釋液并置于50 mL的比色管中，待用。

1.2.2.1 氧化劑、還原劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液9份，分成3組，第1組分別加5、10、15 mL 的重餾水；第 2 組分別加 5、10、15 mL 30%的過氧化氫溶液；第3組分別加5、10、15 mL 1%的亞硫酸鈉溶液。用90%乙醇溶液定容至25 mL，充分混合后避光靜置30 min，在665 nm[8-9]波長處測定吸光度。

1.2.2.2 金屬離子對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，分別加入濃度均為1 mol/L的氯化鐵、氯化亞鐵、2、4、6 mL。用乙醇定容至25 mL，充分混合后避光靜置30 min，在665 nm測定吸光度。

1.2.2.3 酸、堿性對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，分別加入 1、2、3、4、5mL的3 mol/L鹽酸溶液和3 mol/L氫氧化鈉溶液。用乙醇定容至25 mL，充分混合后避光靜置30 min，在665 nm測定吸光度。

1.2.2.4 食品添加劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，分別加入濃度均為1 mol/L的檸檬酸、蔗糖、食用碘鹽、谷氨酸鈉溶液5、10、15 mL，充分混合后避光靜置30 min，在665 nm測定吸光度。

1.2.2.5 食品加工中溫度對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，分別將每組置于常溫（20 ℃）、50、70、80、90、100 ℃的水浴鍋中水浴處理10 min，取出后迅速冷卻，在665 nm測定吸光度。

1.2.2.6 光照在食品加工中對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，分別將每組置于黑暗處，太陽光照下，紫外線光照下，處理30 min～60 min后全部遮光，在665 nm測定吸光度。

1.2.2.7 食品貯藏時間對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

取稀釋樣液并分組編號，遮光常溫密封保存，每隔5天測一次吸光度。

2 結(jié)果與分析

試驗結(jié)果用吸光度平均值±標準誤表示，或采用Origin7.5軟件進行繪圖；顏色變化與PANTONE色卡比對。

2.1 氧化劑、還原劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

分別以H2O2、Na2SO3為氧化劑、還原劑對小麥苗葉綠素進行作用，加入氧化劑后樣液由明亮的綠色（PANTONE 348U）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（PANTONE 115U），從低劑量到中劑量吸光度下降，高劑量組相對中低組吸光度有所上升；加入低劑量的還原劑樣液無明顯變化，高劑量的還原劑使樣液由透亮的綠色（PANTONE 348U）轉(zhuǎn)變?yōu)闇啙岬木G色（PANTONE 353U），吸光度隨之增大。測試結(jié)果如表1所示。

表1 氧化劑、還原劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 1 Influence of oxidize,reducing agent on stability of wheat seedling chlorophyll

與空白組相比，氧化劑、還原劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性起到了不同的作用；氧化劑有破壞作用，低劑量的氧化劑即可對樣液的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著的破壞效果，且隨濃度的增大破壞作用增強；還原劑有保護作用，中、低劑量的還原劑對樣液的穩(wěn)定性有顯著的保護作用，但高劑量的還原劑對葉綠素的穩(wěn)定性有顯著的破壞作用；空白組中隨著H2O的添加量增加，吸光度明顯的下降；由于水的增加，降低了乙醇的濃度，進而使葉綠素的溶解度和濃度降低。

2.2 金屬離子對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

通過定量添加FeCl2、FeCl3研究亞鐵離子、鐵離子對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響，加入FeCl3后樣液由翠綠色（PANTONE355U）變?yōu)辄S褐色（PANTONE 7409U），加入FeCl2后樣液顏色由深變淺，失去明亮的色澤。測試結(jié)果如表2所示。

Fe2+、Fe3+對葉綠素穩(wěn)定性均有顯著破壞作用，破壞作用與劑量高低呈正相關(guān)關(guān)系，且Fe3+的破壞力要強于Fe2+；葉綠素分子的中鎂元素與4個吡咯環(huán)處于同一個平面上[1]，這種結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，導(dǎo)致鎂離子極易從葉綠素分子中央脫落，從而在溶液中和鐵離子、亞鐵離子發(fā)生置換反應(yīng)，形成相對應(yīng)的顏色。

2.3 酸、堿性對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

通過定量添加HCl、NaOH，研究加工介質(zhì)的酸堿性對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 酸、堿性對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 3 Influence of acids and bases on stability of wheat seedling chlorophyll

分別滴加酸和堿溶液后樣液吸光度都呈現(xiàn)出顯著的下降。大體上吸光度的下降程度與酸、堿的濃度成正相關(guān)關(guān)系，且堿液濃度與吸光度的下降程度的相關(guān)性更為明顯。酸和堿都對葉綠素的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大的影響，并且酸的影響要大于堿，酸使葉綠素溶液變成淡黃綠色（PANTONE 388U），堿使葉綠素溶液顏色色度下降并略有渾濁質(zhì)感呈現(xiàn)出黃綠色（PANTONE 390U）。

2.4 食品添加劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

定量添加常見食品添加物（檸檬酸、蔗糖、加碘食鹽、谷氨酸鈉）研究添加量及時間對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 食品添加劑對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 4 Influence of food addities on stability of wheat seedling chlorophyll

加入檸檬酸后樣液由翠綠色（PANTONE 348U）變?yōu)辄S色（PANTONE 3955U），吸光度下降。加入蔗糖、加碘食鹽、谷氨酸鈉后樣液的顏色基本沒有變化。5 d后觀察發(fā)現(xiàn)蔗糖組顏色仍是明亮的翠綠色其余組為黃色（PANTONE 3955U）或黃綠色（PAN－TONE 379U），所測得的吸光度可看出小麥苗葉綠素樣液整體呈現(xiàn)下降趨勢，其中蔗糖處理組吸光度下降程度明顯小于另外3組。

2.5 食品加工中溫度對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

根據(jù)試驗結(jié)果繪制小麥苗葉綠素提取液的吸光度與食品加工溫度之間的關(guān)系圖，如圖1所示。

圖1 溫度對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Influnence of temperature on stability of wheat seedling chlorophyll

由圖1可知，小麥苗葉綠素樣液在不同的加工溫度下降解速度不同，在80℃附近出現(xiàn)明顯的拐點，80℃之前降解速率比較緩慢，80℃之后降解速率加快，當(dāng)溫度達到90℃以上時葉綠素含量急速下降。

2.6 光照在食品加工中對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

分別以遮光、紫外線、復(fù)合光（太陽光）對樣液進行處理，結(jié)果如表6所示。

表6 不同光照對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 6 Influence of different light on stability of wheat seedling chlorophyll

在避光處理過程中小麥苗葉綠素提取液基本不發(fā)生變化，在紫外線照射處理后小麥苗葉綠素樣液顏色仍然為翠綠色但吸光度出現(xiàn)了明顯的下降說明紫外線對小麥苗葉綠素有一定的降解作用。經(jīng)復(fù)合光（太陽光）照射處理后小麥苗葉綠素樣液由翠綠色變成了淡黃色（PANTONE 3945U），且吸光度急劇降低說明太陽光對離體的葉綠素有較強的破壞降解作用。這可能是因為葉綠素中多不飽和雙鍵很不穩(wěn)定。

2.7 食品貯藏時間對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響

根據(jù)實驗結(jié)果繪制小麥苗葉綠素提取液與貯藏時間之間的關(guān)系圖，如圖2所示。

圖2 貯藏時間對小麥苗葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influnence of storage time on stability of wheat seedling chlorophyll

隨著貯藏時間的延長小麥苗葉綠素樣液的吸光度逐漸降低，且初期下降快后期逐漸變緩。小麥苗葉綠素的含量隨加工時間的延長而降低，降解速率隨時間的延長而減緩。顏色變化是：明亮的綠色（PANTONE 348U）—橄欖綠（PANTONE 582U）—黃綠色（PANTONE 584U）—明亮的黃色（PANTONE 102U）。

3 討論

H2O2具有氧化性，葉綠素分子中存在多不飽和雙鍵，極易被氧化。加入中低劑量H2O2致使小麥苗葉綠素被氧化，但高劑量H2O2會在氧化作用的同時產(chǎn)生細微的氣泡干擾吸光度造成吸光度值的增加。Na2SO3對植物多酚氧化酶具有強烈的抑制作用[7]，且Na2SO3具有還原性，還原性要強于葉綠素。少量的還原劑可以保護葉綠素，防止葉綠素被介質(zhì)中的氧氣、氧化酶氧化。過量的Na2SO3使溶液呈堿性，葉綠素與游離的OH-發(fā)生反應(yīng)，使得提取液變渾濁，表現(xiàn)為吸光度增大。

在酸性環(huán)境中離體葉綠素中的鎂原子被溶液中的氫替換，發(fā)生格林反應(yīng)[8]，使得葉綠素樣液由翠綠色變?yōu)榈S綠色，同時吸光度下降。在堿性環(huán)境中葉綠素與氫氧化鈉發(fā)生了皂化水解反應(yīng)，生成了氫氧化鎂、葉綠酸鹽、葉綠醇等物質(zhì)，使得葉綠素樣液顏色變淺，表現(xiàn)為吸光度下降。

溫度對葉綠素穩(wěn)定性影響機理有兩方面：一、溫度升高葉綠素降解，高溫促使降解速度加劇；二、較高溫度加劇葉綠素卟啉環(huán)中心的Mg2+脫落引起褪色[9]。小麥苗原液中的葉綠素耐受溫度在80℃附近，因此介質(zhì)溫度大于80℃后葉綠素穩(wěn)定性急劇下降。謝宇奇等[4]研究中發(fā)現(xiàn)芒果葉葉綠素穩(wěn)定性在80℃附近出現(xiàn)拐點，這與本試驗結(jié)果一致。

在食品添加劑試驗中，蔗糖在葉綠素粗提液中發(fā)生水解，水解產(chǎn)生的葡萄糖和果糖對葉綠素有一定的保護作用。由于檸檬酸為有機酸，葉綠素與有機酸發(fā)生反應(yīng)，葉綠素空間結(jié)構(gòu)被破壞故而更容易發(fā)生降解。蔗糖（及其水解物）、加碘食鹽、谷氨酸鈉相對分子較大、性質(zhì)穩(wěn)定，其溶液將葉綠素分子包裹，起到了一定的隔離保護作用。顧聲音[10]在對竹葉葉綠素穩(wěn)定性研究中也表明一定濃度的蔗糖溶液、味精溶液對葉綠素護綠有增益作用，可在本實驗基礎(chǔ)上進一步探究蔗糖對小麥苗葉綠素的最佳護綠濃度。

在光照下，活性氧往往可激活碳環(huán)的多不飽和雙鍵而引起葉綠素環(huán)降解;而且自然光中可見光及紅外線可以產(chǎn)生熱量，提高溫度，從而加速自由基等氧化性強的物質(zhì)對葉綠素的破壞作用;同時長時間光照也會導(dǎo)致葉綠素光敏氧化，降解為無色產(chǎn)物，從而使葉綠素含量大幅度降低[11-13]。魏俊等[14]研究發(fā)現(xiàn)菠菜葉綠素對光照和紫外線照射都比較敏感，本試驗結(jié)果則表明小麥苗葉綠素有較好的抗紫外線效果，這種差異可能是由于不同物種所含葉綠素的種類與比例不同。

樣液葉綠素降解速率隨貯藏時間的增加呈現(xiàn)出先快后緩的特點，這主要是由于降解的葉綠素分子并非完全分解，而是以葉綠素片段或部分結(jié)構(gòu)而存在于樣液中當(dāng)小麥苗葉綠素樣液降解到一定程度后，溶液中的葉綠素片段或部分結(jié)構(gòu)接近飽和，使得葉綠素的有了重組的可能，進而產(chǎn)生了葉綠素的降解與重組的動態(tài)平衡。在施瑛等[15]的研究中表明小麥汁中含有大量黃酮類物質(zhì)，且具較強的抗氧化作用。本實驗材料是小麥苗粗提液，含有一定量的植物黃酮，樣液由綠變黃至恒定的過程可能是葉綠素降解及植物黃酮抗氧化作用的綜合結(jié)果。

4 結(jié)論

不同濃度的氧化劑、Fe3+、Fe2+、酸、堿、檸檬酸、加碘食鹽、谷氨酸鈉溶液以及80℃以上的溫度、復(fù)合光照射，均會使小麥苗粗提液中的葉綠素含量降低；此外氧化劑、Fe3+、Fe2+、酸、檸檬酸、復(fù)合光照會使小麥苗葉綠素粗提液發(fā)生不良色變，使粗提液由明亮的綠色變?yōu)椴煌潭鹊狞S色；而還原劑、堿、蔗糖、加碘食鹽、谷氨酸鈉溶液以及紫外線照射對粗提液的顏色變化影響較小；粗提液中葉綠素含量隨貯藏時間呈現(xiàn)出先快后緩的降解趨勢，但低劑量的還原劑、蔗糖溶液對小麥苗葉綠素粗提液有明顯的護綠效果，此外小麥苗葉綠素表現(xiàn)出較強的抗紫外線效果。

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