廢水中硝基苯降解菌的分離鑒定及特性研究

劉小琳 康巧梅

（福建師范大學閩南科技學院 福建泉州 362332）

引言

硝基苯是制造苯胺的主要原材料，廣泛應用于化工、染料和醫藥工業，且在很長一段時間內不會被替代，而工業生產過程中排放的硝基苯對環境和人體健康產生很大威脅，被各國列入優先處理的污染物[1,2]。據統計全世界約有1萬噸/年的硝基苯排入環境中[3]，導致環境承受嚴重負擔，為了降低硝基苯帶來的影響，需要采取有效措施降低硝基苯污染帶來的危害。目前對硝基苯廢水的處理大多采用吸附、氧化、沉淀及輻照等物理化學方法，易引起二次污染[4,5]。而相對于物理化學方法，微生物降解具有成本低、效率高、不易產生二次污染等特點[6,7]。采用微生物降解方式，可以有效修復環境，確保水資源和土壤資源能夠得到循環利用，提高自然環境的自凈能力，維持自然環境可持續發展[8]。但由于工業廢水的污染物濃度和種類有很大差異，培養篩選出對硝基苯化合物有高效、通用的降解菌群，使之應用于廢水處理具有重要的意義。本實驗從三家化工廠排污口的污泥中分離得到以對硝基苯作為單一碳源[9]的高效降解菌，并對其降解特性和種屬關系進行研究和探索，為降解工業廢水中的硝基苯研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

樣本分別取自福建省三家化工廠排污口污泥；大腸桿菌Escherichia coli DH5α由實驗室保存；PMD18-T載體購自Takara生物公司。

1.1.2 主要培養基和試劑

無機鹽培養基：NaCl1.00g/L，(NH4)2SO41.00g/L，K2HPO41.50g/L，KH2PO40.50g/L，MgSO40.15g/L，KNO31.00 g/L，pH7.0；富集培養基：在無機鹽培養基中添加50mg/L的硝基苯作為唯一碳源；LB培養基；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 降解菌的篩選

分別稱取不同地區排污口污泥2.0g加入50ml無菌蒸餾水，充分震蕩20min，取5ml上清液，加入100ml的富集培養基中，于28℃，180rpm/min的振蕩培養箱中培養3d，待培養基渾濁后，取菌懸液 5 ml加入100ml富集培養基培養，重復轉接5次，進行稀釋，取100 uL涂布于富集培養基固體平板上，28℃培養3d。挑取單菌落接種于富集培養基中，于28℃，180 r/min搖床培養1d，檢測降解效果。

檢測方法：取 5ml培養液，3000 rpm/min，離心20min，取上清液2 ml，用萘乙二胺偶氮光度法測定[10]，同時繪制空白實驗和標準曲線。

1.2.2 菌種M3形態學鑒定

挑取M3單菌落將其接種至2ml富集培養基中，28℃，180rpm/min培養1d，取100ul菌液涂布于富集平板培養基，28℃培養1d，觀察菌落形態。

1.2.3 菌種分子鑒定

1.2.3.1 總DNA提取[11]

取菌液1.5ml，置于1.5mlEP管，12000rmp，離心5min。棄上清，收集菌體。晾干，加入500uL的DNA抽提液，旋渦混勻1-2min，在55℃下保溫1h；加入500uL的酚/氯仿（1:1），混勻 3-6min，溶液呈現乳白色，12000rpm，離心 10min，4℃；取上清液，加入 5μL Rnase，37℃，保溫 20-30min；再加入等體積的氯仿；離心取上清，加入1/10的NaAc(3mol/LpH5.2)和2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min以上，離心棄上清；再加入75%的乙醇1ml，懸浮沉淀；離心棄上清，每管中再加入25μL的ddH2O，在-20℃下保存。

1.2.3.2 16s擴增

用16s通用引物（上游引物：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，下游引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）進行擴增。所有PCR反應均在50μL標準反應體系中進行,其中含有10×PCR緩沖液5 μL，模板DNA、上游引物、下游引物各1μL，dNTP4 μL，Taq 聚合酶 0.5μL，加 ddH2O 至 50ul，于PCR儀上按94℃變性5min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃2 min，重復以上步驟共30個循環，最后72℃延伸10 min。

1.2.3.3 PCR產物回收、連接與轉化

采用切膠純化法，按柱式DNA膠回收試劑盒說明進行。回收獲得的DNA產物與PMD18-T vector在16℃下進行隔夜連接。將連接產物轉入感受態細胞EcoliDH5α進行培養。

1.2.3.4 菌落PCR驗證

挑取轉化子接種于含氨芐（100mg/L）5ml培養基中，37℃恒溫振蕩過夜培養；用同16S rDNA基因PCR的反應體系和條件，用16s上下游引物，進行擴增驗證。

1.2.3.5 測序、比對及進化樹構建

上海生工進行測序，并且對測序結果進行序列拼接、比對和進化樹分析。

1.2.4 菌種M3降解特性的研究

將分離純化得到的M3菌種接于100ml添加有50mg/L硝基苯的無機鹽培養基中，分別改變溫度、pH值和轉速，培養24h后測定硝基苯的降解率，研究溫度、pH和轉速對硝基苯降解率的影響。

2 結果與分析

2.1 降解菌降解能力的測定

經分離純化，在固體平板上得到8株有降解能力的菌種，編號M1到M8。然后，將8株菌接種于添加有硝基苯的液體無機鹽培養基（硝基苯初始濃度為25mg/l），經48h培養后，測定降解率。結果見圖1所示，8株菌種均能降解硝基苯，其中M8對硝基苯的降解率最低，僅為12.53%，M3對硝基苯的降解率最高，達56.94%，因此初步認定M3為高效降解菌種。

2.2 M3菌落形態的觀察

菌種M3于28℃，培養24h，其菌落形態為卵圓形，顏色微黃，表面濕潤，如圖2所示。

2.3 M3基因組DNA的提取

菌種M3的基因組提取結果如圖3所示，DNA條帶位于23.1k左右。

圖2 菌落形態

圖3 基因組DNA提取

2.4 16SrDNA序列克隆及系統發生樹構建

2.4.1 16SrDNA序列克隆

以總DNA為模板，16S通用引物進行PCR擴增獲得16s基因序列，如圖4所示，PCR擴增產物在1200bp和1400bp之間。

2.4.2 16SrDNA測序結果

由上海生工測序，獲得16srDNA序列，序列長度為1331bp，如圖5所示。

圖4 16SrDNA序列克隆

圖5 16SrDNA序列

2.4.3 進化樹的構建

測序后將菌株16SrDNA的基因序列與Genebank上的基因序列進行相似性分析，由進化關系圖6可知，該菌株屬于假單胞菌屬，與編號NR043533、GQ254277、KU131279.1的菌株親緣關系最近。

圖6 進化樹分析

2.4.4 菌種M3的降解特性

2.4.4.1 溫度對M3降解率的影響

如圖7所示，在20℃—40℃范圍內，隨著溫度的升高，降解率先升后降，在30℃降解率最高。由此可知，M3降解硝基苯的最佳溫度為30℃。

圖7 溫度對M3降解率的影響

2.4.4.2 pH值對M3降解率的影響

如圖8所示，隨pH值的升高，M3的降解率呈上升趨勢，在pH為7的條件下，M3表現出最好的降解效率，隨后降解率呈下降趨勢。由此可知，M3降解硝基苯的最佳pH為7.0。

圖8 pH對M3降解率的影響

2.4.4.3 轉速對M3降解率的影響

如圖9所示，隨著轉速的提高，M3的降解率逐漸提高，但轉速高于150rpm/min時，降解效率不再顯著增加，趨于穩定。由此可知，M3降解硝基苯的最佳培養轉速為150rpm/min。

圖9 轉速對M3降解率的影響

結語

從化工廠污泥中分離得到8株具有降解硝基苯能力的菌種。其中菌種M3降解率最高，降解率為56.94%，對其進行形態學和16SrDNA分析，初步鑒定其為假單胞菌屬。降解特性研究結果表明，M3在30℃、pH7.0、轉速高于150rpm/min的條件下具有高的降解效率。

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