禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及應用

張 曼，韓 飛，沈文正，何亞鵬

(楊凌職業技術學院，陜西楊凌 712100)

禽巴氏桿菌病由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起，該病已成為養雞業中最常見的傳染病之一，主要引起成年雞出現急性敗血癥狀，發病率高，死亡率高，有時為慢性經過，表現為慢性呼吸道癥狀，生產性能下降。該病在世界各國廣泛流行[1-2]，危害較大，目前對該病的診斷仍普遍采用傳統的病原分離及血清學等方法[1,3]。雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum)引起的一種急性呼吸道傳染病[4]，可導致育成雞生長遲緩、蛋雞產蛋量顯著下降，死亡率較低，但容易在雞群長期存在[5-6]，從1980年起，已在中國10多個省(市)爆發流行，給中國養禽業造成嚴重的危害。目前的診斷方法主要有臨床診斷、細菌分離鑒定和血清學等方法[7]。大腸桿菌病的病原為大腸桿菌(Escherichiacoli)，所有年齡段的雞群都可能發生，發病率高，臨床表現主要為嚴重腹瀉和敗血癥[8-10]。有研究[11]表明，死亡雞胚中大腸桿菌的分離率高達20%，在禽類養殖中危害廣泛。為降低3種細菌病對禽類養殖造成的損失，降低致病性細菌導致的食源性疾病對人類生命健康的威脅，加強其檢測手段具有重要的公共衛生學意義。

由于禽病種類不斷增多、多病原混合感染日益嚴重及臨床癥狀越來越不典型，而常規的臨床診斷、細菌分離鑒定、血清學方法不僅費時費力，且敏感性低、特異性差，容易誤判，難以確診，隨著現代養殖業的發展，快速準確診斷疾病對家禽生產的意義越來越重要。PCR技術具有快速、靈敏、特異性強等優點，在動物疫病診斷上的應用越來越廣泛。本研究參照國內外文獻[1,4,6,8]，針對禽多殺性巴氏桿菌 16S rRNA基因、副雞嗜血桿菌血凝素(HA)基因、大腸桿菌23S rRNA基因序列，設計并合成3對特異性引物，通過優化多重PCR的反應條件，建立鑒別禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌的多重PCR檢測方法，對于檢測3種細菌在雞群中的感染情況和進行流行病學調查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細菌、病毒和細胞株 副雞嗜血桿菌Hpg-1、禽多殺性巴氏桿菌 C48-1購于中國獸藥監察所；大腸桿菌 (ACCC 01633)購于中國微生物菌種保存中心，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、I群禽腺病毒4型(FAV-4)、雞胚成纖維細胞(DF-1)由楊凌職業技術學院動物工程學院實驗室鑒定保存。

1.1.2 待檢病料 83份病料為采自陜西省不同地區規模化養雞場疑似禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌感染病雞的鼻黏液、肺臟、肝臟和淋巴結等。

1.1.3 主要試劑 PremixTaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker為大連寶生物有限公司產品；細菌基因組提取試劑盒為北京天根生化科技公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中登錄的3種細菌的基因組序列，參照文獻[1,4,6,8]，應用Primer Premier 5.0設計3對引物用于擴增3種細菌基因序列的相對保守區(表1)。引物由Inveitrogen 公司合成，稀釋至20 μmol/L，備用。

表1 PCR引物信息Table 1 The information of primer for PCR

1.2.2 細菌DNA提取 將副雞嗜血桿菌 Hpg-1、禽多殺性巴氏桿菌C48-1和大腸桿菌(ACCC 01633)搖菌復蘇，各自取菌液樣品200 μL，根據細菌基因組提取試劑盒試驗步驟，提取細菌毒株全基因組DNA，備用。

1.2.3 單項PCR檢測方法的建立 分別以3種細菌的基因組DNA為模板進行單項PCR擴增。反應體系為25 μL：PremixTaqVersion 2.0 DNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板 1.5 μL，滅菌雙蒸水10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 35 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，32個循環；然后72 ℃ 再延伸8 min，瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，同時以去離子水為模板作陰性對照。

1.2.4 多重PCR擴增條件的優化 多重PCR擴增效果與退火溫度和引物濃度關系較大[8,12]，因此將提取的DNA經質量濃度測定后均稀釋至50 ng/μL，等量混勻作為模板。對多重PCR的退火溫度(45、47、49、51、53 ℃)及禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、大腸桿菌的各引物對終濃度組合(0.5、0.5、0.5 μmol/L；1.0、0.5、0.5 μmol/L；0.5、1.0、0.5 μmol/L；0.5、0.5、1.0 μmol/L；1.0、1.0、1.0 μmol/L)進行優化，以確定多重PCR擴增的最佳條件。

1.2.5 多重PCR特異性試驗 采用優化的多重PCR體系及程序，分別以3種細菌DNA及其混合物為模板，同時以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1細胞的DNA和去離子水為模板，進行多重PCR反應。

1.2.6 多重PCR敏感性試驗 測得3種細菌DNA的質量濃度，進行51～56稀釋，將稀釋倍數相同的DNA等比例混合后作為PCR模板，進行多重PCR，檢測其敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 取臨床混合病料組織樣品研磨液約200 μL，根據細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA，采用優化的多重PCR方法對樣品進行檢測，同時用已經創建的PCR方法檢測樣品[1,4,6,8]，并對結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 單項PCR擴增及退火溫度的選擇

從單項PCR反應后的電泳檢測結果可觀察到663(大腸桿菌)、412(副雞嗜血桿菌)、308(禽多殺性巴氏桿菌) bp的特異條帶，大小與預期一致(圖1)。

2.2 多重PCR引物的優化

取不同濃度的引物組合進行試驗，以篩選最佳的引物濃度。結果表明，大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌的引物終濃度分別為0.5、1.0、0.5 μmol/L或1.0、1.0、 1.0 μmol/L時多重PCR擴增效果最好(圖2)。

M. DL2000 DNA marker；1. 大腸桿菌E.coli；2. 副雞嗜血桿菌H.paragallinarum；3. 禽多殺性巴氏桿菌P.multocida；4. ddH2O

圖1單項PCR擴增
Fig.1ResultofsinglePCR

M. DL2000 DNA marker；1～5. 大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌引物對終濃度分別為0.5、0.5、0.5 μmol/L；1.0、0.5、0.5 μmol/L；0.5、0.5、1.0 μmol/L；0.5、1.0、 0.5 μmol/L；1.0、1.0、1.0 μmol/L Combinations of primers concentration(μmol/L)forE.coli,H.paragallinarumandP.multocidawere 0.5,0.5,0.5；1.0,0.5,0.5；0.5,0.5,1.0；0.5,1.0,0.5；1.0,1.0, 1.0 μmol/L,respectively

圖2多重PCR引物濃度優化
Fig.2TheoptimizationofprimerconcentrationformultiplexPCR

2.3 多重PCR退火溫度優化

選取不同的退火溫度(50～58 ℃)進行多重PCR反應，電泳結果見圖3，退火溫度在52 ℃時多重PCR擴增得到的3個條帶相對更清晰，更亮，所以確定退火溫度為52 ℃。

2.4 多重PCR特異性檢測

選用優化后的多重PCR擴增條件(PCR體系內加入3對引物的混合物)，分別以3種細菌及其混合物、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1的DNA和ddH2O為模板，進行多重PCR反應。結果表明，大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌及其混合物均可擴增出特異的目的片段，而其他樣品均未擴增出條帶，表明該方法特異性良好(圖4)。

M.DL2000 DNA marker；1～5. 退火溫度分別為50、52、54、56、58 ℃ Annealing temperatures were 50 ℃,52 ℃,54 ℃,56 ℃ and 58 ℃ respectively

圖3多重PCR退火溫度優化
Fig.3TheoptimizationofannealingtemperatureformultiplexPCR

M.DL2 000 DNA marker；1～9.多重PCR模板分別為禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌+副雞嗜血桿菌+禽多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1的DNA和ddH2O The template of multiplex PCR wereP.multocida,H.paragallinarum,E.coli,E.coli+H.paragallinarum+P.multocida,Salmonellaspp,Staphylococcusaureus,FAV-4,DF-1,and ddH2O

圖4多重PCR特異性試驗
Fig.4SpecificitytestofthemultiplexPCR

2.5 敏感性試驗

測定3種細菌DNA的質量濃度分別為75.9(禽多殺性巴氏桿菌)、64.2(副雞嗜血桿菌)、85.8(大腸桿菌) ng/ μL，采用優化的擴增條件以5倍稀釋的DNA為模板進行PCR反應，測得多重PCR對禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌的DNA的最低檢測量分別為24.3、21.4和28.6 pg/μL(圖5)。

2.6 臨床樣品檢測

由圖6和表2可知，用本試驗建立的多重PCR方法對83份樣品進行檢測，大腸桿菌單純感染的有27份，副雞嗜血桿菌單純感染的有9份，禽多殺性巴氏桿菌單純感染的有15份，副雞嗜血桿菌和大腸桿菌混合感染的有4份，禽多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌混合感染的有7份，副雞嗜血桿菌和禽多殺性巴氏桿菌混合感染的有1份，同時感染3種細菌的2份，陰性17份(圖6，表2)，與已經建立的單重PCR方法檢測結果進行比對，結果一致。

M.DL2 000 DNA marker；1～6. 依次為51～56倍比稀釋3種細菌DNA的混合物 Different dilutions of template from 51-56

圖5多重PCR敏感性試驗
Fig.5SensitivitytestofthemultiplexPCR

3 討 論

禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌作為雞的3種重要病原，容易感染雞只，在雞群中長期存在，導致雞發病和死亡，給養禽業造成重大的損失[1,4,11]，因此，開發可鑒別3種細菌快速、特異且敏感的檢測方法，對于防控這些病原導致的雞類疫病具有十分重要的意義。

M.DL2 000 DNA marker；1.陽性對照 Positive control；2.陰性對照 Negative control；3～23.部分臨床樣品 Some clinical samples

圖6 部分臨床樣品多重PCR擴增Fig.6 Detection of some clinical samples by multiplex PCR

隨著分子生物學的發展，PCR方法已經成為眾多病原檢測和分析的主要手段，但目前研究均未建立通過一次性PCR反應就能檢測和鑒別這3種病原菌的方法[1,4,11]。多重PCR具有高效性、系統性、經濟簡便等優點，是在同一個PCR反應體系中加入兩對或兩對以上的引物，并能同時擴增出對應的多個核酸片段的方法[8]。多種病原體在同一反應管內可以同時被檢出，將大大節省時間、試劑和費用。本研究針對中國養禽業中面臨的雞傳染性鼻炎、雞巴氏桿菌病和大腸桿菌病多發的嚴峻形勢，建立多重PCR方法，旨在對這3種疫病的病原菌進行快速精確檢測，為防控疫情爭取有利條件。建立的檢測方法能在短時間內對3種細菌進行準確鑒別診斷，優于細菌分離和眾多單重PCR檢測方法。

建立一種多重PCR檢測方法須經一步步的條件優化才能達到預期的效果。試驗過程中，引物濃度及退火溫度經過優化，各目的片段能夠有效地擴增；敏感性試驗結果表明，該方法最低檢測量分別為24.3 pg/μL禽多殺性巴氏桿菌、21.4 pg/μL副雞嗜血桿菌和28.6 pg/μL大腸桿菌的基因組DNA，具有很高的靈敏性，可以滿足臨床檢測的需要；目的片段均間隔100 bp以上，擴增結果顯示目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區分且無非特異性擴增出現；采用建立的多重PCR方法檢測83份臨床病料，與單重PCR的檢測結果一致，結果表明在發病雞群中大腸桿菌感染最多，禽多殺性巴氏桿菌次之，臨床上副雞嗜血桿菌感染雞雖然病死率不高，但因為長期存在，存在多種病原菌混合感染的情況，值得注意。

本研究建立的多重PCR方法可以快速檢測并鑒別禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌，特異性好、敏感度高，能為3種細菌感染的流行病學調查、快速確診和有效防控提供技術支持。

Reference：

[1] 亓英芳,劉家森,張在平,等.禽多殺性巴氏桿菌PCR診斷方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫,2008(7):68-69.

QI Y F,LIU J S,ZHANG Z P,etal.Establishment of a PCR detection method for avianPasteurellamultocida[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinary,2008(7):68-69.

[2] FURIAN T Q,BORGES K A,ROCHA S L S,etal.Detection of virulence-associated genes ofPasteurellamultocidaisolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR[J].PesquisaVeterináriaBrasileira,2013,33(2):177-182.

[3] 管 宇,沈志強,劉吉山,等.應用16S rRNA基因測序法鑒定禽多殺性巴氏桿菌的研究[J].中國預防獸醫學報,2003,25(5):349-352.

GUAN Y,SHEN ZH Q,LIU J SH,etal.The application of 16S rRNA gene sequence analysis in the identification of avianPasteurellamultocida[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2003,25(5):349-352.

[4] 張 歡,侯佳蕾,張彥紅,等.副雞嗜血桿菌PCR檢測方法的建立[J].廣東畜牧獸醫科技,2009,34(1):28-30.

ZHANG H,HOU J L,ZHANG Y H,etal.Establishment of a PCR detection method forHaemophilusparagallinarum[J].GuangdongJournalofAnimal&VeterinaryScience,2009,34(1):28-30.

[5] CHEN X,MIFLIN J K,ZHANG P,etal.Development and application of DNA probes and PCR tests forHaemophilusparagallinarum[J].AvianDiseases,1996,40(40):398-407.

[6] CHRISTENSEN H,BISGAARD M,LARSEN J,etal.PCR-detection ofHemophilusparagallinarum,Hemophilussomnus,Mannheimia(Pasteurella)hemolytica,Mannheimiaspp.,Pasteurellatrehalosi,andPasteurellamultocida[J].PCRDetectionofMicrobialPathogens,2003: 257-274.

[7] RAJURKAR G,ROY A,YADAV M M.Antimicrobial sensitivity pattern ofHaemophilusparagallinarumisolated from suspected cases of infectious coryza in poultry[J].VeterinaryWorld,2010,3(4):177-181.

[8] 許信剛,楊麗花,童德文.鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌和大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫學報,2012,32(4):534-538.

XU X G,YANG L H,TONG D W.Establishment and application of multiplex PCR detection method forStaphylococcusaureus,Streptococcus,Salmonellaspp andEscherichiacoli[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2012,32(4):534-538.

[9] PRABHAKAR P,THANGAVELU A,PRABHAKAR T G,etal.Multiplex PCR for virulence detection ofPasteurellamultocidaisolates of avian origin[J].IndianVeterinaryJournal,2013,90(1): 9-11.

[10] 李永清,甘孟侯.大腸桿菌病防制研究進展[J].中國獸醫學報,2000,20(4):414-416.

LI Y Q,GAN M H.Advance in research of prevention and treatment for avian colibacillosis[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2000,20(4):414-416.

[11] 薛冬玲.致雞胚死亡原因的流行病學調查[D].山東泰安:山東農業大學,2008:61-64.

XUE D L.Epidemiological investigation to the reasons of avian embryo’s death[D].Tai’an Shandong:Shandong Agricultural University,2008:61-64.

[12] 安俊卿,張紅壘,童德文,等.沙門菌、巴氏桿菌和大腸埃希菌多重PCR檢測方法的建立[J].西北農業學報,2013,22(7):24-29.

AN J Q,ZHANG H L,TONG D W,etal.Establishment of multiplex PCR detection method forSalmonella,PasteurellaandEscherichiacoli[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica,2013,22(7):24-29.