豆瓣醬產毒黃曲霉高效拮抗菌篩選鑒定

彭漪，楊繼鴻，梁鳳英，李同靈,3，王芳，張碩，劉松青*

(1.成都師范學院 化學與生命科學學院，成都 611130；2.四川農業大學 資源學院，成都 611130；3.西華師范大學 生命科學學院，四川 南充 637002)

豆瓣醬作為食品調味產業的傳統主導產業，色、香、味俱佳，是川菜必備的調味佳品。它以蠶豆瓣、面粉和本地優質鮮椒為生產原料，采用精細、獨特的傳統工藝自然發酵，時間長、工序多，不少環節易受黃曲霉

污染致使黃曲霉毒素超標，不但造成豆瓣醬大量感染，產生的黃曲霉毒素B1更具強烈致癌、致畸和致突變的危害，對人及動物肝臟組織會造成破壞，嚴重的可導致肝癌甚至死亡[1]，對人類健康存在較大威脅。抑制黃曲霉的產生，降低或完全去除豆瓣中黃曲霉毒素成為豆瓣醬必須要解決的問題。

大多數豆瓣醬采用米曲霉作為動力微生物，主要是因為米曲霉可以產生豐富的酶系。米曲霉產生的酶系主要包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纖維素酶等[2]。這些酶系使得豆瓣中富含氨基酸、芳香酯和抗氧化物質等多種營養成分及風味物質[3,4]。蛋白酶是米曲霉酶系中最重要的酶之一，直接影響原料的蛋白利用率和最終產品的風味[5]。氨基酸態氮(AN)是蛋白質的分解產物，是評價調味食品的質量及營養價值的一項主要指標，它能使豆瓣醬鮮味柔和，并調和香氣，增進色澤，在發酵性食品的分析中有重要的意義[6,7]。同時米曲霉也可能影響黃曲霉的生長、繁殖和產毒，如徐丹等發現米曲霉能夠有效抑制黃曲霉合成AFB1[8]。

對于發酵食品中黃曲霉菌株及黃曲霉毒素B1的抑制目前多采用一些物理的或化學的方法，不僅效果欠佳，還會造成二次污染[9-13]。目前,許多國外的研究均致力于利用微生物抑制黃曲霉，但是，國內對黃曲霉及其毒素的研究主要集中在優化黃曲霉毒素的檢測方法上，在傳統發酵食品中，利用生物防治黃曲霉的報道極少[14]。

本研究擬從制曲的豆瓣中分離篩選黃曲霉拮抗菌并考察其對黃曲霉毒素AFB1合成的抑制作用，達到天然抗菌的目的，以期抑制豆瓣醬中黃曲霉菌生長并降低其產毒量。同時，從制曲的豆瓣中分離篩選對黃曲霉有拮抗作用的米曲霉，研究米曲霉降解AFB1的能力，并初步比較了不同米曲霉發酵豆瓣中氨基酸態氮的含量，從而為提高豆瓣醬營養、風味和安全性研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品材料

蒸煮拌面制曲發酵后蠶豆瓣子(簡稱霉瓣子)：由四川某豆瓣廠提供。

1.1.2 主要試劑

黃曲霉毒素B1酶聯免疫定量測試盒：無錫百奧深科技有限公司生產； Biomiga gDNA kit：美國Biomiga公司生產；引物合成：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；mqumITSL，mqumITSR，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要設備

酶標儀(DNM-9602)：北京普朗新技術有限公司。

1.1.4 培養基

分離篩選用培養基見表1。

表1 黃曲霉拮抗菌選擇培養基及其配方

1.2 拮抗菌分離及篩選

稱取霉瓣子5 g，無菌狀態下粉碎,無菌生理鹽水梯度稀釋，取不同梯度稀釋液 0.1 mL于培養皿中，分別澆注牛肉膏蛋白胨培養基、MRS、YPD、PDA、查氏分離培養基， 30 ℃培養 48 h。待菌落長出后挑取單菌落純化，將純化好的菌株于 4 ℃保藏備用。

取黃曲霉孢子懸浮液10-1，0.2 mL涂布于蠶豆天然培養基上，將牛津杯垂直置于培養基表面并輕壓，加入上述細菌菌株懸浮液10-1，0.2 mL，28 ℃培養3～5天，分別進行3個重復，觀察生長狀況及抗菌情況。

刮取黃曲霉試管斜面上孢子，制作成50 mL的菌懸液，稀釋200 倍，從中取出1 mL均勻涂布在制好的查氏培養基、PDA培養基上。等到菌液完全固定后，用打孔器在米曲霉邊緣打成5 mm的菌餅，每個培養基接1 種米曲霉，1個培養基做3個重復。30 ℃培養，觀察并記錄拮抗情況。

1.3 米曲霉對黃曲霉毒素AFB1的降解能力

將1 mL米曲霉孢子懸浮液與AFB1同時接入50 mL查氏培養基中，于28 ℃，150 r/min，搖床培養5天，檢測AFB1的含量；同時以只含AFB1的查氏培養基作為對照。采用固相酶聯免疫吸附方法(ELISA)測定黃曲霉毒素含量，450 nm酶標儀讀數， 對照標準曲線計算AFB1含量，實驗重復3次。

1.4 不同米曲霉發酵豆瓣中氨基酸態氮含量的比較

干豆瓣煮30 min，剖皮后，掰成2瓣。將米曲霉制成孢子懸浮液，分別噴灑于各份豆瓣上，攪拌混勻，28 ℃發酵培養7天后，再用鹽水浸泡10天，每種菌株做3個重復。發酵完成后采用甲醛法測定其氨基酸態氮含量。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態鑒定

把篩選出的菌株培養于MRS培養基，觀察它的菌落特征，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊(第 8 版)》初步鑒定。

1.5.2 分子鑒定

1.5.2.1 細菌分子鑒定

選用美國Biomiga公司Bacterial gDNA kit按照以下方法提取細菌總DNA。

基尼英語指從英格蘭東北部的紐卡斯爾到泰恩河之間的區域，人們所講的方言。這一地區的人也叫作基尼人。基尼英語也可泛指英格蘭東北部的口音和方言。

DNA提取后純化，進行16S rRNA PCR擴增，引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。以總DNA為模板，選用27F和1492R兩段引物來擴增16S rDNA。

PCR反應體系均為50 μL體積，反應體系組成如下：

2×PCR Mix 25 μL，

27F(10 μmol/L) 1.0 μL，

1492R(10 μmol/L) 1.0 μL，

DNA模板(50 ng/mL) 2.0 μL，

ddH2O 加至50 μL。

按上述組分配制反應液分裝于200 mL PCR管中，加入DNA模板混勻后進行PCR反應。

PCR擴增的反應程序為：

1.5.2.2 米曲霉分子鑒定

采用CTAB法提取米曲霉菌總DNA，具體如下：將5種菌株分別接種于查氏培養基，置于30 ℃培養。4天后，用高壓滅菌的尖頭鑷子取一定量菌絲于滅菌EP 管內, 依次用無菌生理鹽水、20 mmol/L EDTA及無菌水漂洗, 然后用無菌的吸水紙將菌絲吸干。加20 mmol/L Tris·HCl 和20 mmol/L EDTA 各10 μL，放于-70 ℃，冰凍30 min 后，用滅菌后的研缽研磨5～10 min。重復上述冰凍研磨步驟。研磨后冰浴2～3 min，用重蒸水將研磨液稀釋。

加2% CTAB，100 mmol/L Tris·HCl (pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，65 ℃水浴45～60 min。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，12000 r/min 離心25 min。取上層水相再加入0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，4 ℃放置20 min，10000 r/min 離心10 min，棄上清液，70%乙醇洗滌沉淀2 次。最后提取的DNA溶于30 μL TE緩沖液中。

DNA提取后純化，進行PCR 擴增，引物為米曲霉ITS區全長序列mqumITSL和mqumITSR。

PCR反應體系均為50 μL體積，反應體系組成如下：

DNA模板鏈 2 μL，

2×Taq master mix 25 μL，

hqum-caIS 1 μL，

hqum-caIR 1 μL，

ddH2O 加至50 μL。

按上述組分配制反應液，分裝于200 mL PCR管中，加入DNA模板混勻后進行PCR反應。

PCR擴增的反應程序為：

PCR反應產物的檢測：擴增產物用含有EB的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將每個PCR產物3 μL與溴酚藍1 μL混合點樣，100 V電泳30 min。UV下觀察，檢測擴增片段的長度和濃度。擴增片段長度為1.5 kb左右。將擴增產物保存于-20 ℃備用。

PCR 產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物送擎科生物有限公司測序，測序結果采用BLAST在Gen Bank進行比對，查找同源性高的相關基因序列，最后通過MEGA 5.05軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉拮抗菌株的篩選

2.1.1 黃曲霉拮抗菌株的篩選——細菌

從霉豆瓣中分離得到75株菌株，利用牛津杯實驗篩選得到40株對產毒黃曲霉有抑制作用的菌株，其中10株抑制效果明顯，見表2。

表2 黃曲霉拮抗菌抑菌效果 cm

在牛津杯篩選實驗中，一方面黃曲霉菌開始生長，另一方面待測菌呈球面擴散，離杯越近，待測菌濃度越大，離杯越遠，待測菌濃度越小。隨著待測菌濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內，黃曲霉菌不能生長，而呈透明的圓圈，形成“抑菌圈”，見圖1。

圖1 6株高效拮抗菌對產毒黃曲霉的抑制作用

注：a為7號菌，b為3號菌，c為8號菌，d為9號菌，e為1號菌，f為2號菌；黃色箭頭所指為黃曲霉，紅色箭頭所指為牛津杯，黑色箭頭所指形成的抑菌圈，影印效果無法呈現，詳情詢本社編輯部。

圖2 1～10號菌抑菌圈大小

抑菌圈越大，抑菌效果越好，表明此待測菌為黃曲霉有效拮抗菌。由表2可知，2-4，2-5，2-8，2-9，2-10，2-11，1-4，1-7，1-10，3-2抑菌圈較大，最大值達1.6 cm，抑菌效果明顯，是黃曲霉的高效拮抗菌，對其依次進行重新編號：1～10號。

對1～10號菌抑菌圈大小進行顯著性差異分析，由表3可知，顯著性差異范圍為0.79 f～1.60 a；其中7號與3號，3號與9號，9號與8，2號，8號與2，1號，2號與1，5，6，4號，1號與5，6，4，10號無顯著性差異；而7號與10號顯著性差異最大，7號為1.60 a，10號為0.79 f，相差0.81。由圖2可知，7號抑菌圈最大，3號次之，10號最小，平均抑菌圈大小在1.00 cm左右。

表3 1～10號菌抑菌圈大小顯著性差異分析(α=0.05)

2.1.2 黃曲霉拮抗菌株的篩選——米曲霉

通過培養皿內對峙試驗，從19株米曲霉中篩選到對黃曲霉有拮抗作用的菌株5 株，占到菌株總數的26%。培養7天后，測定各菌株的抑菌圈直徑，結果顯示抑菌圈直徑都達到10 mm以上。其中菌株1P-1，2C-3抑菌圈直徑較大，分別達到了18，16 mm，見表4和圖3。

表4 米曲霉對黃曲霉的抑制效果 mm

圖3 米曲霉對黃曲霉的抑制效果

2.2 米曲霉對黃曲霉毒素AFB1的降解能力

表5 米曲霉對黃曲霉毒素AFB1的降解能力測定

圖4 米曲霉對黃曲霉毒素AFB1的降解率測定

由表5可知，實驗組AFB1濃度均低于對照組，說明本實驗篩選的5株米曲霉均能降解AFB1。且由圖4可知菌株1P-2降解能力最強，其降解率高達69.18%，2C-3和1C-5其次，基本在60%左右。

2.3 不同米曲霉發酵豆瓣中氨基酸態氮含量的比較

將篩選得到的米曲霉及標準米曲霉(滬釀3.042米曲霉)分別發酵后，測定發酵液的氨基酸態氮含量，結果見圖5。

圖5 不同米曲霉發酵豆瓣中氨基酸態氮含量的比較

注：CK-為陰性對照，即未接種米曲霉；CK+為陽性對照，即接種標準米曲霉(滬釀3.042米曲霉)。

由圖5可知，本實驗篩選得到的5株米曲霉中，僅菌株1C-5發酵豆瓣中氨基酸態氮含量略低于標準米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，其余4株即菌株1P-2，2C-3，1C-1和1P-1發酵豆瓣中氨基酸態氮含量均高于標準米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，分別高出8.919%，12.98%，4.537%，22.69%。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態特征

篩選菌株培養于MRS培養基，培養2天后形態特征見表6和圖6。

表6 15株拮抗菌在MRS培養基平板上的培養形態

圖6 1，2，4，5號菌在MRS培養基平板上的培養形態

注：a為1號菌，b為2號菌，c為4號菌，d為5號菌；均為箭頭所指。

2.4.2 分子鑒定

2.4.2.1 細菌分子鑒定

最終選取的10株菌測序后通過比對發現，其中4株菌株(編號分別為1，3，5，6)與葡萄球菌屬菌株的16S rRNA的相似性達 100%；3株菌株(編號分別為2，7，8，9)與庫特氏菌屬菌株的16S rRNA的相似性達 100%；4，10號與克雷伯菌的16S rRNA的相似性達 100%，見表7。

表7 10株菌與參比菌株的相似性

基于16S rRNA基因序列構建了上述10株菌株及其參比菌種的系統發育樹見圖7。該系統發育樹表明，菌株8，9與Kurthiasp.B4的遺傳距離最近；菌株2與Kurthiagibsoniistrain VIT-AKS的遺傳距離最近；菌株4，10與Klebsiellapneumoniaestrain C-X5C的進化距離最近；菌株3與Staphylococcussaprophyticusstrain PJS/1遺傳距離最近；菌株5，6與Staphylococcusgallinarumstrain 2141的進化距離最近；即它們的親緣關系最高。

圖7 基于16S rRNA基因序列10株高效拮抗菌系統發育樹圖

2.4.2.2 米曲霉分子鑒定

5株對產毒黃曲霉活性有較高抑制效果的米曲霉菌株測序后通過比對發現，與米曲霉菌F6的18S rRNA的相似性達 99%。

基于18S r RNA 基因序列構建了上述5株菌株及其參比菌種的系統發育樹，見圖8。

圖8 基于18S rRNA基因序列5株高效拮抗菌系統發育樹圖

該系統發育樹表明5株菌株與米曲霉菌株F6的遺傳距離最近，即它們的親緣關系最高。

3 討論

當前在細菌對黃曲霉的拮抗作用的研發中發現的拮抗菌主要包括乳酸菌屬、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等[15-21]，而本文通過微生物間拮抗作用，首次發現葡萄球菌屬、庫特氏菌屬、克雷伯菌也能抑制黃曲霉且抑制效果顯著。它們是黃曲霉的高效拮抗菌，在糧食生產和儲藏中具有很好的應用潛力。在牛津杯實驗中，10株菌株在平板上形成透明圈，可能原因是這些拮抗菌產生了某些代謝產物抑制黃曲霉菌生長，具體抑制機理下一步將做探究。

本研究篩選的葡萄球菌屬、庫特氏菌屬、克雷伯菌能高效抑制產毒黃曲霉的生長，且這3類菌未曾被發現作為黃曲霉拮抗菌，為以后進一步探究這些拮抗菌抑制產毒黃曲霉生長的機制和食品工業的安全生產提供一定的依據。

氨基酸態氮(AN)能使豆瓣醬鮮味柔和，并調和香氣，增進色澤，氨基酸態氮從而成為評價豆瓣醬質量的重要指標之一，氨基酸態氮含量越高，豆瓣品質越好。本實驗篩選得到的5株米曲霉中，4株米曲霉發酵豆瓣中氨基酸態氮含量均高于標準米曲霉(滬釀3.042米曲霉)，其中菌株1P-1和1C-1的發酵效果較優秀，分別高出22.69%和12.98%，因此將菌株1P-1 和1C-1用于工業生產可大大提高豆瓣醬的氨基酸態氮含量，從而增進豆瓣醬的風味和品質。

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