赤水曬醋中腐敗微生物的生長特性研究

何銀，唐杰，張惟廣

(西南大學 食品科學學院，重慶 400715)

食醋作為一種日常調味品，“多醋少鹽”、“重醋輕鹽”已成為現代人餐桌上的一種時尚追求[1]。醋含有氨基酸、糖類、維生素等營養成分，具有抗菌、殺菌等藥理功效[2]，并有助于防止感冒、腹瀉、骨質疏松等[3]。赤水曬醋采用傳統固態發酵生產方式，擁有悠久的歷史。固態發酵(solid-state fermentation, SSF)指在沒有或者幾乎沒有游離水的濕的固態天然物料作為培養基中培養微生物的發酵過程。其底物多是不溶于水的聚合物，它為微生物提供生長所需碳源、氮源、無機物、水分以及其他營養物質并給微生物提供固定生長場所。固態發酵的本質是在特定發酵條件下，利用微生物對發酵基質中有機物的分解、代謝過程積累代謝產

物[4,5]。但固態發酵以手工操作為主，大部分依靠經驗和積累，設備陳舊，生產周期長[6]，產品體態不夠澄清，保質期內會在瓶口出現浮圈，瓶底形成沉淀，這些現象影響了食醋的感官，甚至影響食醋品質[7]。

本試驗以從赤水曬醋的腐敗醋中分離出的4株腐敗菌(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、耐熱芽孢桿菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為研究對象，探究其在不同溫度、鹽度、酸堿度、防腐劑等因素下的生長狀況，并且確定這幾種微生物耐受高溫的溫度與時間，為解決食醋腐敗問題提供理論參考。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

正常醋與腐敗醋由貴州赤水黔老翁醋廠提供；J1枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、J2類芽孢桿菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、J4耐熱芽孢桿菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、J7地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)由該醋廠的腐敗醋中分離得出。

瓊脂粉、氯化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司；PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DPH-9162型電熱恒溫培養箱、DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；UV1000型可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；DPH-9162型恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器有限公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

取出保存于冰箱中的菌種，劃線于牛肉膏蛋白胨做成的平板培養基，并于(36±1) ℃培養24 h，活化2次。挑取1環菌種加入已滅菌的50 mL牛肉膏蛋白胨的液體培養基中，于(36±1) ℃搖床(轉速50 r/min)培養24 h。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 比濁法

采用吸光值來判定培養液中微生物數量，用分光光度計在600 nm處測定樣品的吸光度[8]。

1.3.2.2 菌落計數法

按照GB/T 4789.2-2016的方法進行計數。

1.3.3 不同因素對5種菌生長的影響

參考生產工藝條件并結合前人的研究制定了如下因素條件[9,10]，探究其在不同條件下的生長狀況。將制備好的J1，J2，J4，J7的菌懸液接種于50 mL的營養肉湯培養基中，使接種后的濃度為105～106cfu/mL，于37 ℃搖床(90 r/min)培養24 h后測定菌液的OD600 nm值[11]，以下試驗均采用此接種和培養方法。

1.3.3.1 溫度

在溫度為10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養，平行3次，并做空白對照。

1.3.3.2 鹽濃度

在氯化鈉含量分別為0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的50 mL營養肉湯培養基中，平行3次，并做空白對照。

1.3.3.3 pH

用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調節營養肉湯培養基的pH為3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，平行3次，并做空白對照。

1.3.4 殺菌處理、防腐劑對菌株生長的影響

1.3.4.1 殺菌溫度對菌株生長影響

在0，80，90，100，110，120 ℃下分別處理20 min，平行3次，并做空白對照。

1.3.4.2 殺菌時間對菌株生長影響

按照如下條件處理： 90 ℃分別處理0，5，10，15，20，25，30 min；100 ℃分別處理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min，平行3次，并做空白對照。

1.3.4.3 防腐劑對菌株生長影響

本研究選用山梨酸鉀和苯甲酸鈉這2種防腐劑作為研究對象，根據GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》進行添加量的選擇，本實驗選用0.25，0.5，1 g/L 3個濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀，添加到液體培養基中。

a.不同濃度防腐劑的配制

為較少誤差，加入防腐劑的體積不應太大，因此配制高濃度的母液。首先用無菌水配制100 g/L山梨酸鉀母液，濃度1 g/L山梨酸鉀的配制：在無菌條件下，吸取0.5 mL山梨酸鉀母液加入到已滅菌的50 mL營養肉湯培養基中，其他濃度防腐劑的配制如上述方法所示。

b.菌懸液接種

將制備好的菌懸液接入已經加入不同濃度防腐劑的液體培養基中，每株菌平行2次并做空白對照，按照1.3.3.1的方法進行培養。

c.結果測定

對4株菌平板計數參考GB/T 4789.2-2016，根據結果計算出菌落總數，并按照以下公式計算抑菌率，由公式可以看出，抑菌率越大，防腐效果越好。

IR(%)=(k0-k)/k0×100。

式中：IR為抑菌率；k0為對照組菌落總數；k為添加不同防腐劑的菌落總數。

1.3.5 數據分析

使用Oringe軟件進行作圖，使用SPSS軟件分析及處理數據，顯著性采用Duncan's多重比較法(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 培養溫度對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養24 h后的OD600 nm值見圖1。

圖1 培養溫度對菌株生長的影響Fig.1 Effect of the culture temperature on the growth of strains

由圖1可知，在處理溫度范圍內，隨溫度升高，4株菌的OD值均呈先升高后下降的趨勢。J1，J2，J7菌株在35 ℃時生長最好，其OD值分別為1.401，0.389，1.359。J4在40 ℃時OD值為0.437，達到最大。菌株J1，J2，J4，J7在培養溫度低于35 ℃時生長逐漸緩慢，在15 ℃時，OD值均小于0.1，生長受到抑制，在10 ℃時，OD值接近零，幾乎不生長。因此，可于15 ℃儲存食醋，以抑制腐敗菌生長。

2.2 含鹽量對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在氯化鈉含量分別為0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的培養基中生長24 h后，測得菌液OD值的變化，見圖2。

圖2 含鹽量對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.2 Effect of sodium chloride content on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由圖2可知，在氯化鈉含量低于2%時，4株菌都能生長，且生長良好，J1，J2，J4，J7菌株均在氯化鈉含量為0時生長最好，OD值分別為1.316，0.420，0.347，1.426。在4株菌中J1，J7能耐受12%的含鹽量，較為耐鹽，J2，J4耐鹽性較差，最大耐受量分別為6%，5%。由試驗結果可知，4株芽孢桿菌具有較強的耐鹽性，在含鹽量為12%時菌株的生長基本受到抑制，含鹽量低于2%時菌株生長良好，本試驗所用醋的含鹽量為(1.97±0.02)%，為抑制菌株生長可將鹽分含量提高至3%，但仍需結合殺菌等其他控制條件。

2.3 pH對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在pH 3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8條件下培養24 h后，測得的菌液OD值變化，見圖3。

圖3 培養pH對菌株生長的影響Fig.3 Effect of culture pH on the growth of strains

由圖3可知，在處理pH范圍內，隨pH升高4株菌OD值呈先升高后下降的趨勢，J1，J2，J4，J7菌株在pH 7.0時，生長最好，OD值分別為1.362，0.408，0.449，與其他pH處理比差異顯著。4株菌在pH 3.0時OD值接近0，菌株基本不生長。由結果可知，芽孢桿菌的耐酸性較強，本試驗所用醋的pH為3.6±0.03，雖能抑制部分菌株的生長，但仍有耐酸的芽孢桿菌生長，因此需要嚴格控制殺菌，以更好地抑制腐敗微生物的生長。

2.4 殺菌溫度對菌株生長的影響

J1,J2,J4,J7菌株在經過不同溫度處理20 min后，培養24 h得到的菌液OD值見圖4。

圖4 殺菌溫度對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.4 Effect of sterilization temperature on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由圖4可知，殺菌溫度從80～110 ℃，OD迅速下降，隨著殺菌溫度上升，OD值降低。在100 ℃殺菌20 min時，OD值明顯降低，說明一般生產中的100 ℃殺菌可以殺死大部分腐敗菌，但是仍有菌株殘留。當處理溫度達到120 ℃時，4株菌幾乎全被滅活，由此可知，芽孢桿菌耐高溫的能力較強。但在實際生產過程中，殺菌溫度過高會增加生產成本，甚至引起食醋口感變差，因此本試驗選擇較為適中的90 ℃和100 ℃進行殺菌溫度的探究。

2.5 殺菌時間對菌株生長的影響

2.5.1 90 ℃處理不同時間對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃下處理0，5，10，15，20，25，30 min后，經過24 h培養后得到的菌液濃度的OD值見圖5。

圖5 90 ℃高溫處理對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.5 Effect of high-temperature processing at 90 ℃on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由圖5可知，J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃，20 min處理后OD值變化均不顯著，90 ℃的處理并不能達到很好的滅菌效果，因此，采用100 ℃再次處理，并延長處理時間。

2.5.2 100 ℃溫度處理不同時間對菌株生長的影響

J1,J2,J4,J7菌株在100 ℃下處理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min處理后，經24 h培養得到的菌液OD值見圖6。

圖6 100 ℃高溫處理對J1,J2,J4,J7菌株生長的影響Fig.6 Effect of high-temperature processing at 100 ℃ on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由圖6可知，在100 ℃時，J1,J7菌株需要處理35 min，J2,J4菌株需要處理30 min才能將菌株滅活。本試驗研究的4種腐敗菌均為芽孢桿菌，耐熱性較好，為盡量延長食醋的保質期，可在較低溫度下儲存食醋，并在保證口感的前提下可稍提高含鹽量，降低酸度，宜采用100 ℃左右的高溫殺菌35 min。

2.6 防腐劑抑菌效果

不同濃度的防腐劑對菌株J1,J2,J4,J7生長的影響結果見表1和表2。

表1 不同濃度山梨酸鉀對菌株生長的影響Table 1 Effects of different concentration of potassium sorbate on the growth of strains

表2 不同濃度苯甲酸鈉對菌株生長的影響Table 2 Effects of different concentration of sodium benzoate on the growth of strains

2.6.1 防腐劑對J1菌株的影響

不同濃度的防腐劑對J1菌株的抑菌率結果見圖7。

圖7 防腐劑對J1菌株的影響Fig.7 Effects of preservative on J1 strain

由圖7可知，2種防腐劑對J1菌株的抑菌率都在94%以上，當2種防腐劑按照1 g/L的濃度添加時，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌率分別97.65%,96.47%，山梨酸鉀效果較優。

2.6.2 防腐劑對J2菌株的影響

不同濃度防腐劑對J2菌株的抑菌率結果見圖8。

圖8 防腐劑對J2菌株的影響Fig.8 Effects of preservative on J2 strain

由圖8可知,在3種濃度下，苯甲酸鈉對J2菌株的抑菌率均在99%以上，苯甲酸鈉對J2菌株的抑菌率優于山梨酸鉀。

2.6.3 防腐劑對J4菌株的影響

不同濃度防腐劑對J4菌株的抑菌率結果見圖9。

圖9 防腐劑對J4菌株的影響Fig.9 Effects of preservative on J4 strain

由圖9可知，當按照1 g/L的濃度添加時，山梨酸鉀和苯甲酸鈉對J4菌株的抑菌率分別為99.25%，95.18%，山梨酸鉀的抑菌效果優于苯甲酸鈉。

2.6.4 防腐劑對J7菌株的影響

不同濃度的防腐劑對J7菌株的抑菌率結果見圖10。

圖10 防腐劑對J7菌株的影響Fig.10 Effects of preservative on J7 strain

由圖10可知，2種防腐劑對J7菌株的抑菌率均在96%以上，不同濃度的山梨酸鉀對J7菌株的生長影響較大，在最大濃度時抑菌率達到98.53%。在濃度大于0.5 g/L時的抑菌效果差別并不大，但苯甲酸鈉稍優于山梨酸鉀。

根據防腐劑試驗得出：若是要同時抑制食醋中的這4種菌，山梨酸鉀效果優于苯甲酸鈉，山梨酸鉀在最大濃度添加時，對J1菌株的抑菌率為97.65%，對J2菌株的抑菌率為96.72%，對J4菌株的抑菌率為99.25%，對J7菌株的抑菌率為98.53%。由表1和表2可知，雖然防腐劑對腐敗菌的生長有一定的抑制效果，但是若初始菌濃度過高，添加防腐劑后的菌濃度仍然較高，因此，若是殺菌條件控制不好，僅通過添加防腐劑不能保證產品品質。

3 結論

J1,J2,J4,J7菌株在15 ℃時生長很微弱，在溫度為10 ℃時幾乎不生長；J1，J2，J4，J7菌株能耐受的最大鹽度分別為12%，6%，5%，12%；在pH 4.0以下時，所有菌株生長微弱，受到抑制，pH 3.0時OD值接近0，不能生長。若殺菌時間在20 min時，應選用120 ℃才能完全滅活，選用100 ℃殺菌時，需要處理35 min才能將菌株滅活。若是要同時抑制食醋中的這4種菌，山梨酸鉀的效果優于苯甲酸鈉，在最大濃度添加時，對這4株菌的抑制率均為96%以上。

[1]李幼筠.中國固態發酵食醋工藝剖析[J].江蘇調味副食品,2002(6):8-9.

[2]陳建文.食醋的保健作用[J].山東食品科技,2001(6):23.

[3]章國洪,譚檑華,章麗霞,等.論食醋功能及產品多樣化現狀[J].中國調味品,2013，38(3):21-24.

[4]江輝.基于近紅外光譜和電子鼻技術的固態發酵過程檢測研究及應用[D].鎮江:江蘇大學,2013.

[5]朱瑤迪.鎮江香醋固態發酵參數的智能在線監測及其分布研究[D].鎮江:江蘇大學,2016.

[6]張立強.酒精制醋連續發酵工藝的研究[D].濟南:山東輕工業學院,2008.

[7]宋智猛.去除固態發酵食醋中渾濁沉淀的生產工藝[J].中國釀造,2012(8):147-148.

[8]張小麗.脹袋醬油中產氣微生物的分離、鑒定與特性研究[D].杭州:浙江工商大學,2015.

[9]王蔚瑜.面筋腐敗微生物的分離與控制研究[D].廣州:華南理工大學,2013.

[10]楊榮杰.食醋中產膜菌株的分離鑒定及其特性研究[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2012.

[11]蔣高強.榨菜腐敗微生物的分離、鑒定及其特性的研究[D].杭州:浙江大學,2006.