CD44分子的體外巖藻糖基化修飾對兔骨髓間充質干細胞歸巢能力的影響

肖飛，焦競，黃玉成，徐海，左偉，王俊文

(武漢市普愛醫院，湖北 武漢 430000)

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖異常活躍，且具有多向分化潛能，在不同誘導環境下，能向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多類細胞分化，是組織工程相關研究被廣泛應用的種子細胞[1]。現已證實BMSCs可以作為支架載體材料或復合生物材料應用于動物骨缺損模型的治療中[2]。然而在臨床應用中的效果并不理想，其中最重要的一個原因便是該細胞在體內定向歸巢能力較差，無法進一步發揮高效的修復作用。

肖飛，焦競，黃玉成，等.CD44分子的體外巖藻糖基化修飾對兔骨髓間充質干細胞歸巢能力的影響[J].實用骨科雜志，2018，24(2)：143-147.

體外培養的BMSCs注射到受體外周血后，若想定向到達受損的骨區域，必須經過兩個階段：第一，必須要克服血管內血流的剪切力，滾動到靶組織血管內皮細胞表面；第二，BMSCs需要通過一系列黏附分子牢固的結合到內皮細胞表面，進而遷移到受損的組織[3]。而在血液中BMSCs的滾動和黏附能力取決于BMSCs表面歸巢相關因子造血細胞E和L受體(hematopoietic cellE-selectin/L-selectin ligand，HCELL)與廣泛表達于骨髓微血管內表皮的P/E-選擇素相耦合作用[4]。HCELL在其半乳糖端連接有α-2，3-唾液酸基團，N-乙酰胺基葡萄糖端連接有α-1，3-巖藻糖基團，形成一個唾液酸化LewisX(sialyl-LewisX，sLeX)的結構，這種sLeX結構正是與E-選擇素耦合的分子基礎[5-6]。而CD44分子的N-乙酰胺基葡聚糖端缺乏α-1，3-巖藻糖基團的修飾，于是設想如果將α-1，3-巖藻糖基團連接于CD44分子N-乙酰胺基葡萄糖端，將使BMSCs表面具有足夠多類似HCELL分子結構，從而增強BMSCs在血液中的滾動和黏附能力，促進其定向歸巢作用。

本研究采用兔BMSCs為研究對象，構建穩定表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的BMSCs，后通過體外巖藻糖基化修飾處理穩定表達EGFP的兔BMSCs，骨損傷兔體內注射BMSCs后，檢測處理前后BMSCs歸巢能力的變化情況，這將為BMSCs在細胞治療、基因治療、組織工程和再生醫學中的應用奠定一定的理論基礎，且具有重要的理論意義和較大的應用前景。

1 資料與方法

1.1 實驗動物選取2個月齡左右的新西蘭大白兔20只，體重1.5～2.0 kg，在相同條件下分籠飼養。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2 主要實驗試劑及材料 含EDFP的慢病毒由華中科技大學同濟醫學院實驗室饋贈；GDP-巖藻酸購自美國Santa Cruz公司；α-1，3-巖藻糖轉移酶VI(FTVI)購自美國R&D公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；嘌呤酶素、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Sigma公司；FITC標記的小鼠抗兔CD29抗體、CD34抗體、CD44抗體、CD45抗體購自美國BD公司；兔血清基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)以及單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的ELISA檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠抗兔一抗SDF-1，MCP-1以及山羊抗小鼠IgG二抗均購自Abcam公司；小鼠抗EGFP一抗購自Millipore公司；SP免疫組化二抗試劑盒-通用型購自Invitrogen公司；其他常用化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 兔BMSCs的原代分離、培養及形態學鑒定 取新西蘭大白兔一只，以3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)經耳緣靜脈注射麻醉，從兔股骨粗隆處使用16號骨穿針穿刺，12號腰穿針鉆入骨髓腔后，使用15 mL含肝素鈉的生理鹽水(1 200 U/mL)自12號針注入，從16號針處接取沖出物，將沖出物與1×PBS按1︰1混勻稀釋，等比例加入含percoll的分離液，2 000 r/mim離心15 min，吸取含單個核細胞的乳白色界面層置于另一個離心管中，1×PBS洗滌1次后，用5 mL DMEM培養基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)重懸并轉移至25 cm2培養瓶中，置于37℃、含5% CO2的培養箱中培養。48 h后進行首次換液，以后間隔3 d換液。待原代細胞生長至80%匯合時消化傳代，按1︰3的比例進行傳代接種培養，并記作P1；傳代培養過程中隔日更換培養基，直至貼壁細胞彼此融合至80%時，再重復以上操作進行下一代傳代接種培養，并記為P2，依次類推，傳至P3，為實驗備用。原代培養過程中每日采用倒置顯微鏡對兔BMSCs進行拍照，觀察其生長狀況并做相關記錄。

1.4 流式細胞儀檢測兔BMSCs表面標志物 生長狀態較好的P3代細胞，棄培養基使用0.2%的胰酶消化1 min，收集于15 mL離心管中，1 200 r/mim離心5 min，使用1×PBS洗滌細胞1次后，細胞計數分管，各管中加入單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45，同時每管設置陰性對照組，避光孵育40 min。使用1×PBS洗滌細胞2次后，500 μL1×PBS重懸，流式細胞儀上機檢測。

1.5 穩定表達EGFP的兔BMSCs的篩選 取生長良好的P3代BMSCs以1.0×105個/mL接種于6孔板中，待細胞生長到約80%匯合時，加入3 mL DMEM培養基和1 mL的含EDFP的慢病毒液(滴度：1.25×108TU/mL)，置入5% CO2，37℃恒溫培養箱中培養，期間使用含0.5 μg/mL的嘌呤霉素的DMEM培養基進行細胞篩選培養。首次培養24 h后，每日在倒置熒光顯微鏡下進行細胞生長狀態以及EGFP的表達情況觀察。

1.6 兔BMSCs的體外巖藻糖基化處理 收集生長狀態良好穩定表達EGFP的兔BMSCs，使用HBSS清洗2次，加入提前配置好的α-1，3-巖藻糖轉移酶Ⅵ反應體系(將60 mU/mL α-1，3-巖藻糖轉移酶Ⅵ溶于5 mL含有20 mM HEPES、1%HAS及1mMGDP-巖藻酸的HBSS)，37℃孵育40 min。4℃，1 200 r/mim離心5 min，棄上清，使用HBSS清洗一次，重懸細胞于2% PBS至濃度約為5.0×106個/mL備用。

1.7 兔脛骨骨折模型構建與實驗分組 選取新西蘭大白兔15只，適應性暫養1周后開始實驗。依次開通耳緣靜脈，注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)，麻醉起效后將兔仰臥位固定于手術臺上，左后肢脫毛、碘伏消毒、鋪巾。取小腿前內側切口4～5 cm，鈍性分離脛前肌，暴露兔脛骨，以擺鋸于脛骨中段人為造成橫形骨折，后用7孔微型解剖鋼板1枚，螺絲釘6枚固定骨折端，骨折線上下各3枚螺絲釘。以生理鹽水沖洗后分層關閉切口。術后將兔隨機分成三組：對照組(Control)5只，每只尾靜脈注射2 mL生理鹽水作為對照；BMSCs治療組(BMSCs)5只，每只尾靜脈注射2 mL未經巖藻糖基化處理的BMSCs(5.0×106個/mL)；巖藻糖基化處理的BMSCs治療組(BMSCs+Fuc)5只，每只尾靜脈注射2 mL經巖藻糖基化處理的BMSCs(5.0×106個/mL)。兔麻醉蘇醒后按分組放入籠內同條件繼續飼養，所有兔均予20萬U的青霉素一次肌肉注射，持續3d。術后6周處死各組兔，取樣進行相應檢測。

1.8 ELISA進行兔血清中SDF-1、MCP-1水平檢測 術后6周處死各組兔，采取3組兔血液樣本，血液樣本采集后在室溫下放置20 min，離心，吸取上清液，-20℃保存待測，待所有血清樣本收集完后，分別采用兔血清SDF-1和MCP-1的ELISA檢測試劑盒，按照說明書操作方法進行相應檢測，根據標準品和樣品的吸光度值，計算三組血清樣本中SDF-1、MCP-1水平。

1.9 損傷骨組織SDF-1、MCP-1的Western Blot檢測 術后6周處死各組兔，取手術損傷處骨組織提取總蛋白、BCA試劑盒對蛋白進行濃度測定后進行Western Blot檢測。操作步驟如下：取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上；PBS洗膜；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加入對應一抗(SDF-1，1︰2 000；MCP-1，1︰2 000)4℃，孵育過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗小鼠IgG(1︰5 000)孵育0.5 h；PBS洗膜；用DAB化學放光進行顯色。以GAPDH為內參蛋白，后采用Quantity One圖像分析軟件進行半定量分析。

1.10 免疫組化檢測損傷骨組織EGFP的表達 術后6周處死各組兔，取手術損傷處骨組織。固定后，EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋，制作切片；將制作好的切片置于pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中進行抗原修復，PBS沖洗，滴加小鼠抗EGFP一抗(1︰1 000)，4℃孵育過夜；按照免疫組織化學試劑盒中指示滴加二抗，孵育30 min；PBS沖洗3次，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果，以出現棕黃色染色判定為陽性結果。后采用IPP 6.0計算機圖像分析系統計算EGFP陽性染色百分比，后進行統計分析。

2 結 果

2.1 BMSCs的形態學鑒定 倒置顯微鏡下觀察(見圖1)，原代培養48 h換液，可見部分細胞貼壁生長，呈梭形或多邊形狀(見圖1a)；培養至3 d時，細胞呈現梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀；培養至9 d時，細胞逐漸融合成片，形成單層細胞，細胞形態均一，呈梭形生長，細胞生長旺盛；傳代培養至P3代時，BMSCs在形態學上更加趨于一致，為排列更加有序的成纖維細胞樣細胞，純度達90%以上(見圖1b)。

a 原代分離48 h b 傳代培養3 d

圖1 不同時期BMSCs的形態學觀察(×200)

2.2 BMSCs的流式鑒定 流式細胞術對分離培養的兔BMSCs表面標志物的檢測結果顯示見圖2，CD29，CD44成陽性(見圖2a，2c)，陽性率分別為97.81%，95.24%；CD34和CD45均成陰性(見圖2b，2d)，陽性率僅為1.85%和2.89%，符合BMSCs表面標志物的表達特征。

2.3 穩定表達EGFP的BMSCs的篩選 熒光顯微鏡下的觀察結果顯示見圖3，培養48 h后即可在轉染了帶EGFP慢病毒的BMSCs中看見明亮的EGFP表達(見圖3a)，繼續篩選到3周后，可在BMSCs中看見大量明亮的EGFP表達(見圖3b)，說明篩選培養得到了持續穩定表達EGFP的兔BMSCs，為后續實驗提供了可靠的實驗材料。

2.4 血清中SDF-1、MCP-1水平檢測(ELISA) 手術6周后處死各組兔，采集血液，收集上清，ELISA檢測結果顯示見圖4，與對照組相比，普通BMSCs治療組SDF-1、MCP-1的分泌水平均顯著上升(見圖4a，P<0.05)；與普通BMSCs治療組相比，經體外巖藻糖基化處理的BMSCs治療組SDF-1、MCP-1的分泌水平均極顯著上升(見圖4b，P<0.01)。

2.5 Western Blot檢測SDF-1、MCP-1蛋白表達水平 手術6周后處死各組兔，取損傷處骨組織，提取全蛋白，Western Blot檢測結果顯示見圖5a，與對照組相比，普通BMSCs治療組SDF-1、MCP-1蛋白的表達水平均顯著上升見圖5b～5c，P<0.05)；與普通BMSCs治療組相比，經體外巖藻糖基化處理的BMSCs治療組SDF-1、MCP-1蛋白的表達水平均極顯著上升(見圖5b～5c；P<0.01)。

2.6 免疫組化檢測損傷骨組織EGFP的表達 手術6周后處死各組兔，取損傷處骨組織，制作切片，EGFP免疫組化染色結果顯示(見圖6)，相對于未經巖藻糖基化處理的BMSCs治療組而言，經巖藻糖基化處理過的BMSCs治療組兔損傷骨組織處的EGFP陽性面積比值較多，且二者差異顯著(P<0.05)，說明BMSCs經巖藻糖基化處理后，到達損傷骨組織處的BMSCs明顯增多，歸巢能力明顯增強。

3 討 論

目前研究表明，臨床骨損傷修復的主要難題為體內成骨緩慢。BMSCs作為一種具有多向分化能力的干細胞，在骨損傷修復方面具備極大的發展前景[7]。干細胞定向到達損傷部位跟其歸巢能力密切相關，干細胞歸巢是指自體的或外源性的干細胞在多種因素的作用下穿過內皮細胞定向遷移至靶向組織血管并定植的過程[8-9]。這一過程中，BMSCs需跨越血管內皮細胞和細胞外基質并在多種趨化因子、生長因子及黏附分子作用下實現歸巢和植入，從而進一步發揮修復作用[8]。

盡管目前對BMSCs向炎癥或損傷組織歸巢的具體機制尚不清楚。但已有研究表明，這可能與炎癥或損傷組織表達能夠誘發并導致與遷移、黏附及穿出相關的特異性受體和配體的調節作用密切相關[10]。對于如何有效地增強BMSCs向靶向組織歸巢的能力，主要有以下幾種途徑：a)合適的培養環境：為了獲取足夠數量的BMSCs，往往需要在體外對其進行培養擴增。這就不可避免的導致BMSCs在培養過程中發生老化或氧化損傷，從而影響細胞的增殖、多向分化和歸巢潛能。Bolno等[11]人研究發現，粒細胞集落刺激因子可通過影響其表面CD44與其受體的結合能力從而來提高BMSCs的歸巢能力；b)轉染有利于歸巢的基因至BMSCs：主要是將一些能夠影響BMSCs歸巢能力和活性的趨化因子、黏附分子等基因分子轉染或轉導至BMSCs，從而增強它們的表達并發揮相應作用。例如，Zhou等[12]人證明轉染了SDF-1基因的BMSCs能明顯強化BMSCs的動員、遷徙、穿出和定植能力。劉舉等[13]人的研究表明MCP-1的體外誘導能顯著提升小鼠BMSCs的靜脈移植效率；c)提高BMSCs對血管內皮的黏附能力；回輸的BMSCs黏附于血管內皮上是其歸巢至靶向組織行使修復功能的前提。Sarkar等[14]人通過生物素-鏈霉親和素化學結合法將包含sLeX結構的納米級聚合物結合至BMSCs表面，從而使其具有與E選擇素和P選擇素緊密結合的能力。并通過體內實驗證明高表達sLeX的BMSCs對于炎性組織歸巢能力顯著強于對照組。Sackstein[15]則通過研究證明了糖基化工程酶化處理BMSCs表面CD44分子，將其轉化為具有向骨歸巢能力的HCELL分子，從而提高其對血管內皮細胞表面E選擇素的結合能力，并通過體內實驗證明了巖藻糖基化處理后的BMSCs向骨髓歸巢的能力顯著增強，且仍保持其多向分化能力。說明通過體外特定方式處理BMSCs，提高其對血管內皮的黏附能力，能夠有效促進BMSCs回輸體內后的靶向歸巢能力。

a CD29表達的流式檢測 b CD34表達的流式檢測 c CD44表達的流式檢測 b CD45表達的流式檢測

圖2 流式細胞術檢測BMSCs表面標記物

a 轉染EGFP慢病毒48h b 轉染EGFP慢病毒3周 a SDF-1 b MCP-1

圖3 穩定表達EGFP的BMSCs的篩選 圖4 血清中SDF-1和MCP-1的ELISA檢測

a 免疫印跡結果 b SDF-1 c MCP-1

圖5 損傷骨組織中SDF-1和MCP-1蛋白水平的Western Blot檢測

a BMSCs b BMSCs+Fuc c EGFP免疫組化陽性率比較

圖6 不同BMSCs治療情況下損傷骨組織EGFP的表達

本研究采用EGFP作為標記物探究經巖藻糖基化處理的BMSCs在缺損部位的歸巢情況。結果顯示，骨損傷兔血清及損傷骨組織處的SDF-1和MCP-1均有顯著增加，且到達損傷骨組織處的BMSCs明顯增多。證明經巖藻糖基化處理的BMSCs的歸巢能力得到顯著提升，這一過程可能與SDF-1和MCP-1的相關通路的調節作用密切相關，這將為臨床上干細胞的骨損傷修復研究奠定可靠的理論基礎。

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