實驗紅鯽C1HD系遺傳質量控制地方標準的研究

吳端生，劉 娟，張朝暉

(1.南華大學實驗動物學部，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學藥學與生物科學學院，湖南 衡陽 421001； 3.南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽 421001)

目前，國際上常用的實驗魚類有斑馬魚、青鳉、虹鱒、劍尾魚等10余種[1-7]，國內科技工作者還常使用稀有鮈鯽、鯉魚、金魚、鯽魚(紅鯽)等10余種[1-5]。然而，具有中國本土特色的標準的實驗魚類卻非常缺乏。目前，稱得上中國本土“準標準”實驗魚類的只有實驗稀有鮈鯽和實驗紅鯽。

實驗紅鯽是由紅鯽馴化而來，紅鯽是鯽的變種，分布于我國長江流域，屬于我國的本土魚類。吳端生等[8-10]經過多年研究，發現紅鯽作為實驗動物具有體型較小、繁殖力強、雜食性、紅體色等優點，并成功培育出實驗紅鯽近交品系，命名為實驗紅鯽C1HD系。2016年12月湖南省質量技術監督局[11]發布了《實驗魚類 實驗紅鯽C1HD系遺傳質量控制》湖南省地方標準(以下簡稱本標準)。本文報道本標準的研究與編制發布的過程。

1 標準編制的目的與意義

隨著社會經濟發展與科技進步，實驗魚類在生物醫藥、水生態毒理學、水產動物疾病防治、水產藥物研制等領域的應用越來越多[1-7]，尤其在化學品、農藥、除草劑、化肥及工業排污的環境安全性評價中顯得特別重要[12-14]。加強實驗魚類標準化研究、建立實驗魚類質量標準是進一步完善實驗魚類法制化、標準化管理體系的需要, 有助于提升實驗魚類的科技水平和對科技創新的支撐能力與服務水平, 并依法為實驗魚類行政許可、行政執法管理提供技術保障和科學依據[15]。目前，我國還沒有本土實驗魚類的國家標準，編制發布的本標準是我國本土實驗魚類的第一個地方標準，為規范實驗紅鯽C1HD系的保種及生產，開展遺傳質量監測提供了技術規范和法規依據，并為實驗紅鯽C1HD系的應用提供了標準參數。

2 標準編制的依據和原則

本標準編制的依據是國家和湖南省的實驗動物管理法規。《實驗動物管理條例》第七條規定：“實驗動物遺傳學、微生物學、營養學和飼養環境等方面的國家標準由國家技術監督局制定”；《湖南省實施<實驗動物管理條例>辦法》第二十四條規定：“實驗動物質量監測應當執行國家標準；尚未制定國家標準的，執行相應的行業標準或者地方標準”。本標準的主要技術參數取自于作者多年來對實驗紅鯽標準化研究的成果和本標準研究的驗證性試驗[10,16]。

本標準的編制遵循科學性、先進性和可操作性原則，力求內容及表述的簡明和準確，并充分考慮我國和我省的實情，適應我國科學技術發展水平。標準文本格式按照《標準的結構和編寫》(GB/T 1.1—2009)[17]給出的規則起草，內容的編寫參照了國內同類標準[18-20]。

3 標準編制與發布的過程

本標準的編制工作于2012年獲得湖南省質量技術監督局的立項(湘質監發[2012]531號)。隨即，成立了標準“編制委員會”和“起草小組”。然后經過驗證性試驗、文獻調研、同行專家咨詢等過程，起草了本標準征求意見稿和編制說明，分別征求省內外同行專家提出修改意見。再根據專家修改意見，形成本標準的送審稿。湖南省質量技術監督局標準化處組織召開專家審查會，對本標準送審稿逐條地進行了審查。再根據專家審查會的綜合意見，形成本標準報批稿。最后，經湖南省實驗動物管理辦公室推薦，報湖南省質量技術監督局批準，于2016年12月發布本標準，即《實驗魚類 實驗紅鯽C1HD系質量控制》(DB43/T 1191—2016)[11]。

4 本標準的內容及主要技術參數

本標準的內容包括前言、范圍、規范性引用文件、術語和定義、主要生物學特性、繁殖方法、養殖環境、遺傳學質量檢測及附錄A、B、C等。其中，主要生物學特性部分對外形、可數性狀、可量性狀、解剖特征、生長發育、繁殖生理特性、染色體數目與核型、體色標記、生化遺傳標記、DNA分子標記等內容進行了表述。繁殖方法部分對育種繁殖方法、保種繁殖方法、生產繁殖方法等內容進行了規定。養殖環境部分對水環境指標、飼養密度等內容進行了規定。遺傳學質量檢測部分對抽樣方法和檢測頻率、性狀測定、體色分析、染色體核型檢測、生化遺傳標記檢測、DNA分子標記檢測、結果判斷等內容進行了規定。

按照遺傳學原理，并參考哺乳類實驗動物遺傳質量控制標準和養殖魚類種質系列標準[18-28]，本標準在實驗紅鯽標準化研究和驗證性試驗的基礎上，分別采納了分類形態學、細胞遺傳學、同工酶、血液生化、DNA分子標記等方面的技術參數。

4.1 分類形態學特性

體色全紅，身體側扁，全鱗，口端位，無須，單尾。3 月齡以下的個體體色為青灰色，3 月齡以上的個體體色逐漸轉為紅色。

4.2 生長與繁殖特性

在普通環境條件下飼養，1年齡的實驗紅鯽C1HD系平均體長約66 mm，平均體重約12 g。2年齡的實驗紅鯽C1HD系平均體長約113 mm，平均體重約34 g。

1年齡即達性成熟，屬于一年多次產卵類型，性成熟的雌性紅鯽在生殖季節里卵巢系數達16%～21%。

4.3 染色體數目與核型

體細胞染色體數2n=100。核型：中部著絲粒染色體(m組)11對，亞中部著絲粒染色體(sm組)15 對，亞端部著絲粒染色體(st組)12對，端部著絲粒染色體(t組)12 對，染色體臂數(NF)152。

4.4 遺傳標記

4.4.1 體色標記

紅體色為實驗紅鯽C1HD系體色基因純合時的形態學標記。

4.4.2 生化遺傳標記

血清蛋白聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳圖譜具有SP-A1、SP-B7 和SP-B8特征帶，此為實驗紅鯽C1HD系的血清蛋白標記。

紅細胞酯酶同工酶(EST)和超氧化物歧化酶同工酶(SOD)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中，EST-1、EST-3 酶帶和SOD-3、SOD-8酶帶分別為實驗紅鯽C1HD 系特有的酯酶同工酶標記和超氧化物歧化酶同工酶標記。

4.4.3 DNA分子標記

序列為“GACTAAGCCC”的隨機引物的PCR擴增產物中，長度為2100 bp 的DNA電泳條帶，為實驗紅鯽C1HD 系的隨機擴增多態性標記(RAPD)。

序列為“3′ATTGTGAAGCATCGGTAATGC和5′TACTTGATTTGCTATTGGAC”引物的PCR 擴增產物中，長度為67 bp 的DNA電泳條帶，為實驗紅鯽C1HD系的微衛星標記(SSR)。

5 遺傳質量控制方法

按照實驗動物標準化管理要求，本標準從保種繁殖和種群遺傳質量兩方面規定了實驗紅鯽C1HD系的遺傳質量控制方法。

5.1 種子保存方法

根據遺傳學原理，應選擇科學的保種繁殖方法來保持實驗紅鯽C1HD 系的同基因性及其基因純合性。因此，本標準規定，將實驗紅鯽C1HD系設立為基礎群和生產群，以基礎群保種。從基礎群中挑選健壯的2 年齡雌性實驗紅鯽C1HD系，采用人工誘導雌核發育技術進行繁殖生產，其子代用于構建實驗紅鯽C1HD 系下一代的基礎群，如此傳代。

5.2 繁殖生產

本標準規定，生產群用于繁殖生產。生產群的實驗紅鯽C1HD系以人工授精方法進行隨機交配繁殖，且繁殖代數不得超過3代。

5.3 遺傳質量監測

5.3.1 保種繁殖的監控

本標準規定，每一世代均采用人工誘導雌核發育技術進行保種繁殖。繁殖生產過程中設置繁殖記錄(卡)、繁殖系譜和繁殖生產臺賬，并有完整的記錄。

5.3.2 遺傳質量檢測

本標準規定，對每1世代的每1繁殖批次的實驗紅鯽C1HD系進行1次遺傳質量檢測。

首先對實驗紅鯽C1HD系體色進行檢測。如果體色是灰色或不全部是紅色，則判定為不合格。對體色全部為紅色的個體，再進行可數性狀檢測。當體色檢測結果和可數性狀檢測結果均符合本標準時，可初步判定為合格?？蓴敌誀顧z測結果可疑或有必要時，再進行生化遺傳標記或DNA標記的檢測，必要時進行染色體核型的檢測。對被檢個體的體色、可數性狀、生化遺傳標記或DNA 標記等項目的檢測結果均符合本標準規定的，則判定為合格。

6 討論

6.1 國內外同類標準研究現狀

國內，對實驗魚類標準的研究始于本世紀初，主要集中在劍尾魚、斑馬魚、實驗紅鯽、蝦虎魚、稀有鮈鯽等。

2000年左右，中國水產科學院珠江水產研究所吳淑勤等就開始了劍尾魚標準的研究。中華人民共和國農業部[19]于2012年3月1日發布了《劍尾魚 RR-B系》中華人民共和國水產行業標準(SC/T1115-2012)，2012年6月1日實施。

2007 年，國家人口計生委科學技術研究所聯合中國食品藥品檢定研究院、中國科學院水生生物研究所、北京大學等單位，開展了實驗用魚地方標準的系統研究[15,29-32]。由北京市質量技術監督局[20,33-37]于2013年正式頒布了《實驗用魚》北京市地方系列標準(DB11/T 1053.1-2013～DB11/T 1053.6-2013)，并于2014年4月1日開始實施。該標準主要適用于斑馬魚和劍尾魚，包括微生物學等級及監測、寄生蟲學等級及監測、遺傳質量控制、配合飼料技術要求、環境條件、病理診斷規范等六個部分的內容。

最近，柯賢福等[38]在應用斑馬魚的基礎上，也開展了斑馬魚的環境設施、養殖用水及飼料標準等研究，以期建立實驗用斑馬魚的浙江省地方標準。

2013年，以稀有鮈鯽為標準供試生物的國家標準《GB/T 29763-2013 化學品稀有鮈鯽急性毒性試驗》由上海市檢測中心聯合原環境保護部化學品登記中心、中國科學院水生生物研究所等5 家單位共同研制完成，并正式頒布實施[39-40]。2014年國家標準化管理委員會又批準了由上海市檢測中心牽頭的六家單位共同參與《化學品稀有鮈鯽幼體生長試驗》國家標準編制工作(項目編號20140324-T-469)[40]。

2009年，廣東省實驗動物監測所向全國實驗動物標準化技術委員會申報《實驗動物 魚類環境與質量控制標準》編制并獲得立項(編號20091329-T-469)。2014年底，由廣東省實驗動物監測所等5家單位起草完成了《實驗動物 魚類環境與質量控制》等5個國家標準送審稿。該標準主要適用于斑馬魚、劍尾魚和諸氏鯔蝦虎魚。

尚未檢索到國外的實驗魚類標準。不過，美國實驗動物研究所等編寫的《實驗動物飼養管理和使用指南》相當于行業標準，它對科研、測試和培訓用的實驗魚類在水生小環境和大環境、水質、生命維持系統、溫度、濕度和通風、照明、噪音與振動和飼養與管理等方面均有較詳細的規定[41]。類似的還有《歐洲保護用于實驗和其他用途的脊椎動物公約》等[42-44]。

6.2 本標準的實施

本標準于2016年12月29日由湖南省質量技術監督局發布，于2017年2月28日開始實施[11]。因為實施的時間不久，未見有用戶不良反映，政府主管部門也尚未將實驗紅鯽納入實驗動物許可證管理范圍。

6.3 建議與展望

值得注意的是，單一的遺傳質量標準不利于實驗紅鯽的應用和標準的推廣，還應該編制完善的實驗紅鯽標準系列。業內人士指出，實驗魚類疾病的控制和健康狀況的維持是實驗魚類標準化研究的核心內容和首要環節[38,45]。實驗紅鯽C1HD系的微生物與寄生蟲學質量控制和環境質量控制是制約本標準推廣的關鍵因素。所以，要全面實施和推廣本標準，還必須相應編制《實驗魚類 實驗紅鯽C1HD系微生物學等級及監測》、《實驗魚類 實驗紅鯽C1HD系環境及控制》和《實驗魚類 實驗紅鯽C1HD系飼料營養及配合技術》等標準系列。目前，這幾部標準的研究工作正在進行，預計2年內完成。

實驗紅鯽C1HD系作為一種標準化的實驗魚類，將有望在水生態毒理學、水產動物疾病模型、化學品環境測試、農藥與重金屬等環境污染檢測等方面得到很好的推廣應用[10]。未來，政府主管部門有必要資助建立國家或省級實驗紅鯽保種繁育中心，并立項編制《實驗紅鯽》國家系列標準。

[1] 吳端生, 王宗保. 魚類實驗動物開發與應用研究的現狀及展望[J]. 中國實驗動物學雜志, 2000, 10(2): 103-109.

[2] 郝智慧, 趙厚德, 鄭海發, 等. 魚類實驗動物的研究與應用[J]. 中國實驗動物學雜志, 2002, 12(5): 70-71.

[3] 吳志強, 邵燕, 袁樂洋. 魚類實驗動物[J]. 生物學通報, 2003, 38(11): 20-22.

[4] 楊笑波, 李建軍, 劉繼芳. 水生動物的實驗研究與應用[J]. 中國比較醫學雜志, 2005, 15(1): 48-50.

[5] 陶宏婷, 吳端生. 水生動物用于科學實驗的最新進展[J]. 實驗動物科學, 2013, 30(5): 59-63.

[6] Schartl M. Beyond the zebrafish: diverse fish species for modeling human disease[J]. Dis Model Mech, 2014, 7(2): 181-192.

[7] Harris MP, Henke K, Hawkins MB, et al. Fish is fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease[J]. J Appl Ichthyol, 2014, 30(4): 616-629

[8] 吳端生, 鄭家銓, 劉冬娥, 等. 紅鯽實驗動物生物學特性的研究[J].中國實驗動物學雜志, 1997, 7(2): 79-81.

[9] 吳端生,王宗保, 張軒杰, 等. 紅鯽近交系的建立[J]. 中國實驗動物學報, 2001, 9(2): 113-118.

[10] 吳端生. 實驗紅鯽標準化研究與應用的現狀及展望[J].實驗動物科學, 2016, 33(3): 56-30.

[11] DB43/T 1191-2016, 實驗紅鯽C1HD系遺傳質量控制[S].

[12] Norrgren L. Fish models for ecotoxicology [J]. Acta Vet Scand, 2012, 54(Suppl 1): S14.

[13] Padilla S, Cowden J, Hinton DE, et al. Use of medaka in toxicity testing [M]. Curr Protoc Toxicol, 2009. Curr Protoc Toxicol. 2009, Chapter 1: Unit 1.10.

[14] 沈敏, Coady K, 董晶, 等. 化學品生態毒性測試魚類模式生物的應用與展望[J].生態毒理學, 2017, 12(2): 34-43.

[15] 孫德明, 王天奇, 朱曉紅, 等. 實驗用魚遺傳質量控制及標準化[J]. 遺傳，2012, 34(9): 1202-1207.

[16] 陶宏婷. 實驗紅鯽遺傳標準參數及核輻射生物效應的研究[D]. 南華大學, 2015.

[17] GB/T 1.1-2009, 標準的結構和編寫[S].

[18] GB 14923-2010, 哺乳類實驗動物的遺傳質量控制[S].

[19] SC/T 1115-2012, RR-B系[S].

[20] DB11/T, 遺傳質量控制[S].

[21] GB 11607-89, 漁業水質標準[S].

[22] GB/T 18654.1, 檢驗規則[S].

[23] GB/T 18654.2, 抽樣方法[S].

[24] GB/T 18654.3, 性狀測定[S].

[25] GB/T 18654.12, 染色體組型分析[S].

[26] GB/T 18654.13, 同工酶電泳分析[S].

[27] GB/T 18654.15, RAPD分析[S].

[28] NY 5051-2001, 無公害食品淡水養殖用水水質[S].

[29] 吳思奡, 王箐, 高昌, 等. 實驗用斑馬魚主要疾病及其實驗動物標準化研究過程面臨的主要問題[J]. 實驗動物科學, 2009, 26(4): 51-56.

[30] 祝梅香, 王天奇, 張長勇, 等. 實驗用斑馬魚劍尾魚營養需求及飼料現狀分析[J]. 中國比較醫學雜志, 2009, 19(12): 61-65.

[31] 孫德明, 穆苑, 高昌, 等. 模型動物斑馬魚及其特定病原凈化[J]. 中國比較醫學雜志, 2009, 19(12): 52-60.

[32] 王天奇, 孫榮澤, 孫德明. 實驗用魚類的水環境及其標準化[J]. 中國比較醫學雜志, 2009, 19(12): 44-51.

[33] DB11/T 1053.1-2013, 微生物學等級及監測[S].

[34] DB11/T 1053.3-2013, 寄生蟲學等級及監測[S].

[35] DB11/T 1053.4-2013, 病理學診斷規范[S].

[36] DB11/T 1053.5-2013, 配合飼料技術要求[S].

[37] DB11/T 1053.6-2013, 環境條件[S].

[38] 柯賢福, 胡慧穎, 吳立仁, 等. 實驗用斑馬魚養殖地方標準的初步探討[J]. 中國比較醫學雜志, 2014, 24(8): 75-78.

[39] GB/T 29763-2013, 化學品稀有鮈鯽急性毒性試驗[S].

[40] 梁藝懷, 張京佶, 石利利, 等. 稀有鮈鯽作為化學品生態毒性測試魚類模式生物的標準化實踐[J]. 生態毒理學報, 2017, 12(2): 2-10.

[41] Institute for Laboratory Animal Research. Guide for the care and use of laboratory animals[M].Washington, D.C. National Academies Press, 2011.

[42] Guillen J. Special Topic Overview：FELASA Guidelines and Recommendations[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2012, 51(3): 311-321.

[43] Federation of Animal Science Societies. Guide for the care and use of agricultural animals in research and teaching[M]. Champaign (IL): Federation of Animal Science Societies，2010.

[44] Vaughn SE. Review of the third edition of the Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2012, 51(3): 298-300.

[45] 熊靜, 關瑞章, 王藝磊, 等. 魚類實驗動物研究概況及標準化研究過程面臨的主要問題[J]. 實驗動物與比較醫學, 2012, 32(4): 366-370.