乳腺癌實驗動物模型的研究進展

李日飛，袁 娜，冶冬陽,3，李日勇，李姚涵，左儒楠，時 晰，陳 強，李引乾*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)，聽覺與平衡醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 徐州 221004； 3.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002； 4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100191)

乳腺癌是全球第二大最常見的癌癥，2012年全球乳腺癌新發(fā)病例達1670萬[1]，且乳腺癌的發(fā)病率每年呈逐漸攀升趨勢。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，2015年僅美國女性乳腺癌新發(fā)病例已經(jīng)超過231000人，男性患者乳腺癌新發(fā)病例約為2350人[2]。隨著乳腺癌相關(guān)研究的不斷深入，乳腺癌動物模型得到了廣泛應(yīng)用，在嚴(yán)格控制有關(guān)條件的情況下，進行乳腺癌發(fā)生發(fā)展規(guī)律以及藥物作用機制等基礎(chǔ)實驗研究，然后進一步作臨床觀察，以尋找預(yù)防治療乳腺癌的有效措施。一個理想的動物模型對研究人類疾病有及其重要的作用，本文就乳腺癌實驗動物模型的制作與評價研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 自發(fā)性實驗動物乳腺癌模型

自發(fā)性乳腺癌是指未經(jīng)人工干預(yù)，在一定年齡階段自然發(fā)生的一類癌癥。目前已培育出小鼠自發(fā)性乳腺癌品系有C3H系、A系、CBA/J系以及TA2系等，大鼠自發(fā)性乳腺癌品系有F334系、ACI系、Wistar大鼠以及SD大鼠等[3]。TA2小鼠是天津醫(yī)科大學(xué)培育的近交系小鼠，基因表型穩(wěn)定，在無任何外來化學(xué)藥物等誘癌刺激下，具有很高的自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率，且病理學(xué)分析表明TA2小鼠乳腺癌細胞呈三陰性[3]。經(jīng)產(chǎn)TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)病率達84.1%，乳腺癌發(fā)生的平均時間為330 d以內(nèi)；處女TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)病率達41.4%，乳腺癌發(fā)生的平均時間為450 d以內(nèi)；雄性TA2小鼠乳腺癌發(fā)病率達32%，乳腺癌發(fā)生的平均時間為479 d以內(nèi)[3]。SP1細胞系來源于自發(fā)性的無免疫原性和無轉(zhuǎn)移性患有管內(nèi)乳腺癌的18月齡CBA/J雌性小鼠體內(nèi)，這種小鼠模型非常適合具有轉(zhuǎn)移性和免疫原性乳腺癌的相關(guān)研究[4]。來自于BALB/C處女雌性小鼠M05腫瘤細胞是另一種含有被證實染色體組型的自發(fā)性乳腺癌模型[5]，M05腫瘤含有兩個不同的細胞系：具有上皮細胞特征的細胞系(LM05-E)和成纖維細胞系(LM05-F)[4]。C3H小鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)病率高，6～10個月齡雌性小鼠乳腺癌自然發(fā)生率達85%～100%，乳腺癌通過乳汁而不是胎盤途徑傳播[6]，因而是常用的自發(fā)性乳腺癌模型動物。

自發(fā)性乳腺癌動物模型有其極大的優(yōu)勢，這種動物最大的特點是無需經(jīng)人工干預(yù)，在一定年齡階段就可自然發(fā)生。從乳腺癌發(fā)生學(xué)上來看，這些自發(fā)性乳腺癌與人體乳腺癌相近，應(yīng)用自發(fā)性乳腺癌實驗動物可進行乳腺癌病因、發(fā)病、防治及抗癌藥物篩選的研究。但自發(fā)性乳腺癌動物模型也有缺點，不同實驗動物個體因受到各種因素的影響，乳腺癌發(fā)生存在差異，實驗周期長，花費較多。

2 誘發(fā)性實驗動物乳腺癌模型

人工誘導(dǎo)(物理、化學(xué)及生物因素等)實驗動物發(fā)生乳腺癌最常用的方式是化學(xué)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)性乳腺癌動物模型可通過給動物注射二甲基苯蒽(7, 12-dimethylbenz(a)anthracene，DMBA)或N-甲基-N-亞硝基脲(N-nitoso-N-methylurea，NMU)而建立[7]。處女雌性(BALB/cDBA/2) F1代雜交小鼠注射二甲基苯蒽(DMBA)可誘發(fā)潛伏期為7個月的乳腺癌[4]。SD大鼠尾靜脈注射NMU (50 mg/kg), 乳腺腫瘤約在14～21周出現(xiàn)，醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate，MPA)與二甲基苯蒽(DMBA)聯(lián)合應(yīng)用可使乳腺癌發(fā)生的潛伏期縮短至3個月，增加了乳腺癌的發(fā)病率[4]。致癌物質(zhì)二甲基苯蒽(DMBA)可誘導(dǎo)乳腺癌中細胞周期蛋白1(cyclin D1)和原癌基因(c-Myc)的表達增加[8]。BALB/c小鼠持續(xù)使用醋酸甲基孕酮(MPA)可誘導(dǎo)具有1年潛伏期乳腺癌的發(fā)生，且發(fā)病率為79%[9]。盛佳鈺等[10]選擇順鉑(DDP)低劑量誘導(dǎo)及體內(nèi)外交叉致瘤結(jié)合的方法建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型，該模型的特點是在傳統(tǒng)的化療藥物單純誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上進行改進，增加了體內(nèi)外交叉致瘤的方法，逐步提高耐藥性，并縮短了致瘤時間，為三陰性乳腺癌臨床個體化治療及耐藥逆轉(zhuǎn)研究等提供參考。骨化三醇處理的乳腺癌大鼠模型，其腫瘤潛伏期明顯擴大，腫瘤的發(fā)生率及多樣性降低，同時導(dǎo)致用NMU處理的腫瘤也大量發(fā)生退化[11]。

誘發(fā)性乳腺癌實驗動物模型較容易制作，誘變劑選擇范圍大且較穩(wěn)定，我們可以根據(jù)研究的需要，使用不同的誘變劑，從而制作出所需的實驗動物模型。注射化學(xué)藥物一段時間后，腫瘤便會出現(xiàn)，但是腫瘤的發(fā)生位點卻是不可預(yù)知的，同一動物可能有多個腫瘤出現(xiàn)。此外，因?qū)嶒瀯游飩€體差異以及誘變劑的類型，腫瘤的發(fā)生和潛伏期都存在差異，誘發(fā)模型參差不齊，對人體乳腺癌的精準(zhǔn)研究造成了一定影響。化學(xué)誘導(dǎo)模型主要用于乳腺癌預(yù)防及早期致癌因素的研究，但通常不用于抗癌藥物的研究[7]。

3 移植性實驗動物乳腺癌模型

移植性實驗動物乳腺癌模型是將乳腺癌組織或細胞接種于實驗動物而培養(yǎng)出來的模型，其有很多優(yōu)點[7]：①可獲得乳腺癌細胞系；②腫瘤細胞可以在同一天移植入實驗動物的一個特異性位點；③腫瘤細胞生長可在不同動物間進行復(fù)制。移植性模型是目前最常用實驗動物腫瘤模型，尤其是人類異種移植物模型[12]，其根據(jù)移植物來源不同可分為同種移植物模型和異種移植物模型。

3.1 同種移植物模型

同種移植物模型是將實驗動物(如嚙齒類動物)乳腺癌的細胞系或組織接種至同種或同品系免疫功能正常的動物體內(nèi)[13]。目前已經(jīng)建立了一些同種移植物模型，如小鼠4T1模型，4T1細胞系是從來源于自發(fā)性乳腺癌Balb/cfC3H小鼠品系的一個亞群體系中分離得到的[7]。有證據(jù)表明，4T1小鼠乳腺癌細胞系移植入免疫功能正常的同品系小鼠體內(nèi)，從而來模擬人乳腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移情況，此種方法比將人乳腺癌細胞系(異種移植物)移植入免疫功能缺陷小鼠體內(nèi)，以此來觀察腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移情況更加有效[14]。源自于小鼠乳腺癌的細胞系(如來源于BALB/c近交系小鼠的4T1細胞或C57/BLk6近交系小鼠的E0771細胞)已經(jīng)在相關(guān)文獻中廣泛報道和利用，從而使具有這種細胞系的同品系小鼠模型的適用性得到了該領(lǐng)域?qū)W術(shù)界的認可和接受[14]。

這種模型將來源于小鼠的乳腺癌細胞移植入同品系小鼠體內(nèi)有兩個好處[14]：首先，同種移植物模型利用免疫功能正常的小鼠，從而來評價在乳腺癌發(fā)生發(fā)展進程和轉(zhuǎn)移過程中免疫應(yīng)答的作用[15]；其次，同種移植物模型可使實驗動物產(chǎn)生相同的腫瘤，這些腫瘤體積大，腫瘤生長速度和轉(zhuǎn)移速度也較異種移植物模型快，臨床應(yīng)用效果較異種移植更有效。同種移植模型是模擬癌癥發(fā)生發(fā)展的重要策略，對研究人類乳腺癌有很重要的作用。然而，同種移植物模型也有一定的局限性：小鼠乳腺癌與人類乳腺癌存在一定的差異，小鼠乳腺癌是以癌癥研究工具為手段人工制作的疾病模型，而不是自然發(fā)生的疾病。此外，人和小鼠的乳腺癌基質(zhì)細胞也存在差異，例如間充質(zhì)干細胞(masenchymal stem cells)的惡性轉(zhuǎn)化程度也不一樣[16]。

3.2 異種移植物模型

異種移植物模型是將人類的乳腺癌細胞或組織移植入免疫缺陷型實驗動物體內(nèi)[13]。目前，在大多數(shù)乳腺癌臨床前試驗研究中，MCF-7、T47-D和MDA-MB-231這3種人類乳腺癌細胞系應(yīng)用的最廣[7]。實驗動物多為免疫缺陷型品系的嚙齒類動物，兩種最常用的品系分別是重癥聯(lián)合免疫(severe combined immune deficiency，SCID)小鼠和裸鼠品系[17]。Ji等[18]在人類乳腺癌異種移植小鼠上研究了持續(xù)使用TM208藥物治療乳腺癌的耐藥性情況，并且鑒定了腫瘤pEGFR表達水平與腫瘤生長抑制的關(guān)系。Yen等[19]研究了將良性和惡性的腫瘤移植物植入裸鼠體內(nèi)來制造裸鼠移植物模型，從而通過造影劑為惡性腫瘤的病變提供一個初步篩選的工具。具體做法是將具有分裂特征的纖維瘤細胞的惡性移植物(細胞和MDA-MB231細胞)和良性移植物同時移植入裸鼠的兩側(cè)，移植成功率可達90%。5周之后，聲波圖上顯示，良性和惡性移植物的體積達到4 cm3(直徑約2 cm)，使人的腫瘤在裸鼠體內(nèi)得到了較好的復(fù)制，該研究為人類疾病的治療提供了參考。Xin等[20]將200 μL MCF-7細胞懸液(5×106)注射入雌性裸鼠左胸廓乳腺脂肪墊中，一段時間后腫瘤的大小可達到100～300 mm3,以此為動物模型來研究槲皮素(Qu)在乳腺癌治療上的作用。

在癌癥研究中，將永生化的人乳腺癌細胞系移植入免疫功能不全鼠科動物體內(nèi)制作的乳腺癌動物模型是最簡單、最常用的模型系統(tǒng)[4]。細胞系異種移植物模型是連接體內(nèi)和體外研究重要的橋梁[21]。細胞系異種移植物模型明顯的優(yōu)勢表現(xiàn)在以下3個方面：①清楚的了解人乳腺癌細胞系的特征；②模擬人腫瘤的特征；③降低研究成本，可快速診斷。然而，異種移植物模型也有其不足之處，尤其在新藥研發(fā)方面有致命的弱點，臨床前研究與臨床用藥結(jié)果有差異[22]。細胞系異種移植物模型的局限性表現(xiàn)在以下幾個方面：①免疫缺陷動物腫瘤的發(fā)生導(dǎo)致來自免疫系統(tǒng)對癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療反應(yīng)的主要作用被忽視；②人的腫瘤與動物基質(zhì)之間聯(lián)系中斷；③部分移植物存在免疫排斥反應(yīng)，裸鼠存活率低；④高度的同質(zhì)性，在臨床乳腺腫瘤中很難反應(yīng)瘤內(nèi)的異質(zhì)性。

4 乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移實驗動物模型

乳腺癌轉(zhuǎn)移實驗動物模型有多種形式，主要包括肺轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等動物模型，但其中以骨轉(zhuǎn)移實驗動物模型研究最為廣泛。

4.1 乳腺癌肺轉(zhuǎn)移實驗動物模型

乳腺癌肺轉(zhuǎn)移實驗動物模型可通過皮下、乳墊原位及尾靜脈接種乳腺癌細胞而建立[23]。曹讓娟等[24]利用慢病毒載體獲得了能夠穩(wěn)定表達GFP的乳腺癌細胞系，將此細胞以皮下注射方式接種于BALB/c裸鼠皮下，從而建立自發(fā)性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，8周后在原位形成直徑約15 mm的腫瘤塊，病理剖檢肺部肉眼未見轉(zhuǎn)移灶，但在激發(fā)光(448 nm)下可見轉(zhuǎn)移灶呈綠色點狀分布。杜鵑等[25]GFP-MDA-MB-231-HM(對照組)和FOXC1-MD A-MB-231-HM(實驗組)單細胞懸液(每毫升2×107)接種于裸鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊，并觀察腫瘤細胞的成瘤性，對照組肺部有明顯的轉(zhuǎn)移灶形成，而實驗組基本無轉(zhuǎn)移灶，說明FOXC1能夠明顯抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。龔宏霞等[26]將第3代處于對數(shù)生長期的4T1-luc細胞用PBS稀釋至每毫升1×106細胞，0.1 mL細胞懸液通過尾靜脈接種于BALB/c小鼠(相當(dāng)于每只BALB/c小鼠接種1×105個4T1-luc細胞)，制作小鼠乳腺癌實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，接種21 d后小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率高達100%，組織病理學(xué)觀察可見肺內(nèi)有腫瘤細胞轉(zhuǎn)移灶，與正常肺組織相比，轉(zhuǎn)移瘤細胞排列緊密、核大深染、核膜清晰、核仁明顯，分裂相多見，病理組織學(xué)診斷為浸潤性癌巢。這三種方法建立的乳腺癌實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，為進一步研究乳腺癌的發(fā)病機理及治療提供了良好的動物模型。

圖1 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模式圖Fig.1 A model sketch of breast cancer-induced bone metastasis

4.2 乳腺癌肝轉(zhuǎn)移實驗動物模型

乳腺癌肝轉(zhuǎn)移實驗動物模型可通過門靜脈接種及瘤組織肝臟內(nèi)接種而建立[27]。Goddard等[28]為了提高乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的建模效率及可實用性，采用小鼠門靜脈注射的方法使腫瘤細胞直接富集在肝臟部位。具體做法是將三種同源性乳腺腫瘤細胞系 (D2A1, D2.OR和4T1) 經(jīng)門靜脈接種于免疫良好的BALB/c小鼠,制作乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，病理組織學(xué)觀察表明3種細胞不同程度發(fā)生了較高的乳腺癌肝轉(zhuǎn)移，門靜脈接種是乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的重要建模手段，可能也適用于其它癌癥肝轉(zhuǎn)移模型的建立。胡孝渠等[29]利用Her2陽性細胞系SKBr-3成功建立自發(fā)性乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，方法是采用瘤組織裸鼠體內(nèi)反復(fù)傳代的方法(第一代原位乳腺癌模型建模成功后進而進行第二代原位種植，最后進行第三代原位種植)，建立了一個高效的，特異性較高的自發(fā)性乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，在13/16 (81%)只裸小鼠中發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，而在所有剖解的小鼠中，肺轉(zhuǎn)移均未出現(xiàn)，說明經(jīng)反復(fù)傳代乳腺癌細胞SKBr-3出現(xiàn)了明顯的嗜肝性的特點，為肝轉(zhuǎn)移發(fā)病機制和治療提供了理想的動物模型。

4.3 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移實驗動物模型

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型在女性中的發(fā)病率高達80%，但目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療還受到一定的限制。針對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型機制的研究是目前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。如圖1是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型機制的模式圖[30]。

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的建模方法有多種形式，主要包括，末梢器官骨定殖模型：骨內(nèi)注射法、自發(fā)性骨轉(zhuǎn)移模型：原位注射法、試驗性骨轉(zhuǎn)移模型：系統(tǒng)(全身)注射法，全身注射又分為尾靜脈注射和動脈或左心室注射。Sloan等[31]通過對高表達αvβ3蛋白的雌性Balb/c小鼠脛骨上端注射乳腺上皮細胞系66cl4，結(jié)果顯示表達αvβ3整合素對破骨細胞招募及骨吸收有促進作用。Zibly等[32]通過皮下將同品系鼠乳腺癌細胞系13762經(jīng)Fisher 344鼠右后肢注射其體內(nèi)獲得腫瘤，將腫瘤(實體瘤)切割后經(jīng)骨內(nèi)注射移植入同品系鼠的胸腰椎骨。結(jié)果顯示，移植入椎骨中的腫瘤生長與脊髓壓迫綜合癥自然發(fā)病過程的復(fù)制是相一致的。Ghajar等[33]為了研究存在在骨中隱匿散布的腫瘤細胞，他們將能夠表達綠色熒光蛋白(GFP)的MDA-MB-231細胞原位注射至非肥胖性糖尿病聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)的小鼠乳腺中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP陽性和Ki67陰性細胞群聚集在股骨和脛骨骨髓的微血管內(nèi)皮上。一些研究者將新鮮的來源于病人的腫瘤細胞和組織進行原位移植，但是自發(fā)性骨轉(zhuǎn)移模型復(fù)制成功的卻很少。DeRose等[34]從來自49例不同乳腺癌病人的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤樣品中，分離得到一系列的細胞系，然后將其移植到雌性NOD/SCID小鼠中，但僅僅只有一個原始細胞系(HCI-007)在2只小鼠中有自發(fā)性骨轉(zhuǎn)移。在制作骨轉(zhuǎn)移模型的過程中，有時會發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，但一些研究表明乳腺癌更容易向骨轉(zhuǎn)移。Garcia等[35]通過熒光成像證明了通過給動物側(cè)部尾靜脈注射B02細胞后，在注射后第一個3 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)肺部有熒光，但向骨轉(zhuǎn)移更為明顯。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型使用最廣泛且可信的方法是心臟注射。一些乳腺癌細胞系經(jīng)心臟注射可在骨骼上成功復(fù)制出溶骨病變模型，并且已經(jīng)用于乳腺癌介導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)移的預(yù)臨床研究[36]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型在動物模型中不是很常見，但目前是人們研究的熱點問題。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型對鑒別和檢查人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展有一定的作用，但這種模型的復(fù)制較為困難，容易發(fā)生他處轉(zhuǎn)移，所以理想的骨轉(zhuǎn)移模型還需人們進一步研究和探索。

5 乳腺癌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬Ｐ?/h2>

轉(zhuǎn)基因動物模型是指將一個外源基因插入動物的DNA中，使得含有該基因的編碼蛋白質(zhì)高表達或低表達，從而來研究其在致癌過程中的作用[7]。這種模型選擇的動物大都為小鼠，且研究的多數(shù)蛋白質(zhì)受鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)啟動子的控制[37]，MMTV控制的致癌基因可導(dǎo)致各種乳腺癌的發(fā)生。脂連接蛋白(adiponectin, APN)在健康人血液中高表達，而在乳腺癌病人中表達較低。Denzel等[38]將鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)調(diào)控元件PyV-mT致癌基因插入APN裸鼠體內(nèi)，從而建立了裸鼠乳腺癌模型，然后檢測腫瘤發(fā)生、動力學(xué)及動物存活數(shù)。結(jié)果顯示，在APN裸鼠中，MMTV-PyV-mT誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生延遲，同時腫瘤的生長率也降低了。MMTV-Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠是研究乳腺癌發(fā)病機理，Wnt信號通路與乳腺癌關(guān)系及抗乳腺癌藥物研究與篩選的良好動物模型[39]。轉(zhuǎn)基因動物模型的蛋白修飾可以使乳腺癌的發(fā)病率提高，這可能會導(dǎo)致其他腫瘤也同時發(fā)生。乳腺癌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬Ｐ偷膬?yōu)點是復(fù)制腫瘤的成功率高，結(jié)果可靠，但其價格昂貴，技術(shù)要求較高，復(fù)制容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤的發(fā)生位點有不可預(yù)知性[7]。

6 結(jié)語

以上綜述了5種乳腺癌實驗動物模型，其各有優(yōu)缺點。研究者應(yīng)根據(jù)實驗研究的需要，而選擇不同的動物模型制作方法。一個理想的動物模型應(yīng)盡可能與人類疾病相一致，這樣所研究出來的成果才能應(yīng)用到人類疾病的診斷和治療上。隨著生物技術(shù)與實驗動物學(xué)的不斷發(fā)展，乳腺癌的研究也越來越深入，研究方法也在不斷的完善，對實驗動物模型選擇應(yīng)更為嚴(yán)格。因此，研究工作者要在動物模型制作上進行創(chuàng)新或在原有基礎(chǔ)上進行改造，制作出與人類疾病盡可能相同的動物模型，這對人類疾病診斷和治療具有重要意義。

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