A型肉毒素重鏈干預對大鼠脊髓損傷后生長相關蛋白表達的影響

王亞芳，蘭 婧，劉 福，白 娟，李夏青

(山西醫科大學基礎醫學院病理生理教研室，太原 030001)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指各種創傷或非創傷因素引起的損傷平面以下運動、感覺和自主神經功能不同程度的喪失。由于成年哺乳動物脊髓損傷后再生能力極為有限[1-2]，損傷后再生障礙，脊髓損傷后致殘率極高，嚴重影響病人的生存質量[3]。脊髓損傷后之所以不能再生的原因歸結于脊髓損傷后局部大量軸突再生抑制因子的產生及損傷脊髓組織內軸突再生相關基因不能上調或激活、細胞或軸突再生相關蛋白合成障礙[4-5]。

A型肉毒桿菌毒素(botulinum neurotoxin serotype A，BoNT/A)是由肉毒桿菌產生的神經毒素之一[6-7]。A型肉毒素的毒性機理主要基于其可選擇性地與運動終板神經突觸前膜上相應受體結合入胞、導致突觸囊泡蛋白25(synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25)裂解、阻斷囊泡內神經遞質(乙酰膽堿)的釋放[8-9]，致使所支配的骨骼肌收縮障礙發生麻痹[10]。除影響乙酰膽堿外，肉毒素也可抑制或阻止突觸囊泡內其它物質的釋放，譬如：降鈣素基因相關多肽(CGRP)、P物質等[11]。從化學結構上，A型肉毒素是由二硫鍵相連的雙肽鏈，其中較長的一條位于毒素氨基端，稱為重鏈(heavy chain，HC), 負責與靶細胞膜結合及介導毒素的內吞；較短的一條位于毒素的氨基側，稱為輕鏈(light chain，LC)。輕鏈部分具有Zn+依賴的蛋白水解酶活性，是毒素的毒性催化單位[12-13]。一些在體實驗發現A型肉毒素引起肌肉麻痹的恢復期(注射后3～4月)，隨著肌肉功能的逐漸恢復，局部組織內可見運動終板樣神經末梢結構[14]。因此，根據BoNT/A化學結構的功能特征，在去除輕鏈的毒性作用后，BoNT/A重鏈本身也可能影響神經細胞的多種功能及其結構變化[15]。

為此，本文擬在大鼠脊髓損傷模型的基礎是，采用人工重組的 BoNT/A重鏈進行髓腔內間斷性給藥，探討其對脊髓損傷后生長相關蛋白表達的影響及其促進神經突起再生的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體重200～220 g, 由北京海淀實驗動物養殖場提供[SCXK(京) 2014-0013]。所有動物在本實驗室獨立動物房飼養[SYXK(晉)2015-0001]，室溫(24±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環，每日提供充足的標準食物與飲水。動物的使用及操作按照本校動物管理委員會(IACUC2017-001)的規定執行，在使用動物的過程中充分考慮動物福利原則，尊重動物，善待動物，最大程度減少對動物的傷害和痛苦。

1.2 主要試劑和儀器

A型肉毒素重鏈購自美國List Biological Laboratories, Inc;PE-10(RWD Life Science，62324，China)；多功能酶標儀(Molecular Devices, SpectraMax@190，USA);多功能電泳儀(Bio-Rad, USA); Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒 (Sangon Biotech, C503031，China);EasySee Western blot kit (TRAN, DW101, China);兔抗磷酸化GAP43單克隆抗體(Thermo Fisher, PAI-4626,USA)；兔抗SCG 10多克隆抗體(Thermo Fisher, 720178, USA)；兔抗-GAPDH 多克隆抗體 (Bioword, AP0063, China)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(Bioword, AP0063, China)；凝膠成像系統(Bio-Rad，USA);冰凍切片機(Leica, 1950-Cryostat, Germany);兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(Bioword, BS4791, China)；Alexa Fluor 594結合的羊抗兔IgG 二抗 (Lifetechnologies, A11012, USA)； Alexa Fluor 488結合的驢抗兔IgG 二抗(Lifetechnologies, A21206, USA)；抗衰變熒光封片劑 (Invitrogen，P36931, USA)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71，Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腰段脊髓半橫斷損傷模型建立

將全身麻醉后的大鼠后背位固定于鼠臺，剃去背部被毛，以髂前上棘確定L3～L4椎間隙，并依次向上確定T9～T10椎間隙。以T9～T10為中心，沿背部正中皮膚切開2～3 cm的切口，分離脊柱周圍肌肉筋膜，暴露椎板，剪去T9棘突并用咬骨鉗移除T9椎板，暴露脊髓。以脊髓正中靜脈為標志，在顯微鏡下，用眼科鑷子從脊髓正中靜脈左側插入直至椎板，橫向夾斷脊髓。止血消毒后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚。蘇醒后的大鼠呈現左后肢拖地行走、抓力顯著下降、熱痛敏時間無限延長。動物置于溫暖環境中常規飼養至實驗終止。

1.3.2 BoNT/A重鏈給藥及實驗分組

通過兩個部位間斷給予BoNT/A重鏈制劑：(1)損傷局部給藥：于損傷同時局部給予BoNT/A重鏈4 μg(4 μg/4 μL)；(2)腰骶部鞘內置管給藥[16]：模型建立后每周給予BoNT/A重鏈2 μg(2 μg/2 μL)。BoNT/A重鏈制劑配置：50 μL 0.9%的醫用無菌生理鹽水溶入一支A型肉毒素重鏈凍干粉中(50 μg),震蕩搖勻，即可配置成A型肉毒素重鏈注射液(1 μL /μg)，每次以20 μL總容量用藥。實驗分為3組(每組6只)：(1)假手術組(Control組)：切開皮膚，剪去椎板、暴露脊髓，但不損傷脊髓；(2)單純損傷組(Injury組)：切開皮膚，剪去椎板、暴露脊髓并行一側脊髓離斷術；(3)脊髓損傷 + BoNT/A重鏈干預組 (BoNT/A HC 組)：單側腰段脊髓離斷同時局部給予及隨后每周鞘內給予BoNT/A重鏈制劑。根據時間點，單純損傷組和脊髓損傷 + BoNT/A 重鏈干預組又分為2 d、7 d、14 d和28 d組。

1.3.3 雙向電泳—硝酸銀染色檢測脊髓蛋白總體表達

各實驗組大鼠分別在不同時間點(2、7、14、28 d)用1%的戊巴比妥鈉深度麻醉，沿原手術部位切開背部皮膚，打開L3～L4以上椎板至脊髓損傷部位，充分暴露脊髓。用剃須刀片切取包括損傷中心、距損傷中心上下各0.5 cm的損傷側脊髓組織。

將標本置于預冷的蛋白裂解液(蛋白裂解液配方：尿素：21 g，硫脲：7.9 g，二硫赤鮮醇(dithioerythritol，DTE): 0.5 g, Tris: 0.5 g純水定容至50 mL)內，用剪刀剪碎，并于玻璃研磨器內進行研磨制備組織懸液，隨后將組織懸液用超聲粉碎機進一步破碎。組織懸液充分混勻后采用Bradford法測定蛋白濃度。每組標本取150 mg蛋白，上樣于 pH 3～10 的NL IPG 預制干膠條進行第一向等電聚焦; 將聚焦完成的膠條用2D equilibration buffer [6 mol/L尿素，50 mmol/Tris-HCl (pH 8.8)，30%甘油，2% SDS，1% DTT，痕量溴酚藍]進行充分清洗和平衡后進行第二向電泳(12.5%的聚丙烯酰胺凝膠)。對完成電泳后的凝膠進行硝酸銀染色。采用Bio-Rad 凝膠成像系統對0.1%硝酸銀染色后的膠條進行成像及分析處理。

1.3.4 選擇性生長相關蛋白的Western blot檢測

每組樣本取20 μg蛋白樣品上樣15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠。將蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入選擇性生長相關蛋白抗體：兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(1∶3000，Thermo Fisher, PAI-4626, USA)或兔抗SCG 10多克隆抗體(1∶1000), 及兔抗-GAPDH 多克隆抗體 (1∶5000)，4℃冰箱搖床過夜；TBST充分洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，充分洗滌后加入新鮮配置發光工作液反應3 min，暗室曝光顯影后，于凝膠成像分析系統上對膠片上的蛋白條帶進行掃描及攝像分析。

1.3.5 免疫熒光檢測

各實驗組大鼠分別在不同時間點(2、7、14、28 d)時在1%的戊巴比妥鈉深度麻醉下用4%多聚甲醛經心插管灌注固定后，取出以損傷脊髓為中心長約0.5 cm的脊髓置于相同固定液中后固定1 h，移入30%的蔗糖溶液中4℃過夜。OCT包埋，制作冰凍切片。由背部向前面的額狀縱切面連續切片，厚度為16 μm。0.1% TritonX-100 穿透10 min，0.1 mol/L 的 PBS洗滌(5 min×3次)，10%正常血清封閉1 h，分別加入選擇性生長相關蛋白抗體：兔抗磷酸化GAP 43單克隆抗體(p-GAP 43，1∶100, Bioword, BS4791, China)或兔抗SCG 10多克隆抗體(1∶500)，4℃ 冰箱孵育過夜。棄去1抗，PBS 充分沖洗(5 min×3 次) 后加入二抗：Alexa Fluor 594結合的羊抗兔IgG 二抗(1∶500) 或Alexa Fluor 488結合的驢抗兔IgG 二抗(1∶500)，室溫避光孵育 1 h，PBS充分沖洗后加入含有抗衰變熒光封片劑，置于熒光倒置顯微鏡下進行觀察并采集圖片。

1.4 統計學方法

注：A:只行椎板切除術，暴露的脊髓及正中靜脈；B:行椎板切除術，且脊髓半橫斷；C：大鼠麻醉蘇醒后手術側后肢拖地行走；D:取出脊髓可見橫斷的斷端；A、B圖中箭頭指示暴露的脊髓和正中靜脈的位置；C圖中箭頭指示手術側后肢；D圖中箭頭指示橫斷脊髓的斷口。圖1 大鼠脊髓腰部半橫斷術大體及體態特征Note.A: Only laminectomy, spinal cord and median vein were exposed. B: Laminectomy and spinal cord hemisection. C: After anesthesia the surgery side dragging the hind leg walking. D: Hemisection of the spinal cord was visible. The arrow points to the spinal cord and the median vein (A,B). The arrow in C points to the surgical side of the hind limb. The arrow in D points to the spinal cord incision.Fig.1 Photos of the exposed spinal cord and median vein during surgery in the SCI group and the movement of the hind limb post-SCI and visible spinal cord incision

2 結果

2.1 單側腰段脊髓損傷模型的大體觀察及術后體態特征

本實驗通過髂嵴解剖學標志定位T9～T10椎骨，并去除第9 椎板暴露腰髓，用眼科鑷子沿脊髓正中靜脈左側夾斷一側腰髓。術后動物呈現左側后肢癱瘓、拖地行走，抓力及熱痛敏感覺實驗表明大鼠運動功能及感覺功能障礙，脊髓損傷模型成功。另外，脊髓大體特征也顯示損傷基本位于腰膨大部位(圖1)。

2.2 BoNT/A重鏈對脊髓損傷后局部蛋白總體表達譜的影響

雙向電泳及硝酸銀染色結果表明單純脊髓損傷后局部蛋白表達與正常呈現明顯不同。損傷后脊髓局部有些蛋白表達下降或升高，這些蛋白表達的增高和降低呈現單獨的蛋白表達點的變化，亦或者是數個點的變化趨勢；給予BoNT/A重鏈后局部蛋白表達的最大特點是：不論單純損傷時蛋白表達的變化如何，BoNT/A重鏈作用下蛋白表達皆呈現升高趨勢， 譬如：分子量35～45 kDa之間、等電點在4～5及分子量在18～25 kDa之間、等電點在7左右的蛋白表達點在單純損傷時較正常對照組增多，而采用BoNT/A重鏈后其表達進一步增多(圖2中紅、綠箭頭所示)。

注：圖中紅綠箭頭指向差異表達的兩個蛋白點。圖2 分子量在18.4～45 kD左右的蛋白表達變化Note.Positions of the differentially expressed spots are indicated with red and green arrows.Fig.2 The differentially expressed proteins whose molecular weight is between 18.4-45 kD

注：與正常對照組相比，#P< 0.05；與單純損傷組相比，*P< 0.05。圖3 BoNT/A 重鏈對p-GAP 43和SCG 10表達的影響Note.Compared with the control group，#P< 0.05. Compared with the injury group, *P < 0.05.Fig.3 Effects of BoNT/A HC on the expression of p-GAP 43 and SCG 10

2.3 BoNT/A重鏈對選擇性生長相關蛋白表達的影響

根據雙向電泳蛋白表達譜的變化，我們選取分子量接近45 kDa的磷酸化GAP-43(p-GAP 43)和分子量位于18.4～25 kDa的SCG 10作為目標蛋白進行免疫蛋白印跡檢測驗證。結果顯示單純脊髓損傷2～7 d時，p-GAP 43和SCG 10的表達皆較正常偏高，而給予BoNT/A重鏈后兩個時間點，局部p-GAP 43和SCG 10的表達增高的趨勢更為明顯，與單純損傷組相比差異有顯著性 (P< 0.05)。隨著損傷時間的延長及連續給予BoNT/A重鏈，當損傷時間達到14 d以上，單純損傷組和BoNT/A重鏈干預組p-GAP 43的表達皆較正常對照組下降，但BoNT/A重鏈干預組的p-GAP 43表達仍較單純損傷組為高(P< 0.05)；而對于SCG 10，當損傷達到14 d和28 d時，其表達略有下降，而給予BoNT/A重鏈的大鼠損傷的SCG 10 表達仍呈明顯增高的現象(圖3)。上述結果表明脊髓損傷后給予BoNT/A重鏈可增強兩種選擇性生長相關蛋白的表達，其變化特征與雙向電泳結果一致。

2.4 BoNT/A 重鏈用藥后p-GAP-43和SCG 10在損傷局部的分布

注：Control、Injury和BoNT/A HC中的Bar=500 μm；Caudal和Rostral中的Bar=20 μm。圖4 BoNT/A HC對p-GAP 43和SCG 10分布的影響Note.Scale bar=500 μm in the control (left), Injury and BoNT/A HC sites. Scale bar=20 μm in the control (right), caudal and rostral sites.Fig.4 Effects of BoNT/A HC on the distribution of p-GAP 43 and SCG 10

采用免疫熒光技術分別對p-GAP 43和SCG 10在脊髓損傷局部的分布變化進行了觀察。與western blot結果相似：在損傷后2、7 d時，脊髓損傷局部的頭尾兩端p-GAP 43和SCG 10的熒光強度都有所增強，免疫熒光陽性的部位主要分布與細胞體；但在損傷14 d后逐漸減弱；采用BoNT/A 重鏈連續給藥后，同時間點損傷局部頭尾端的熒光強度比單純損傷組更為增強(圖4)。高倍鏡下的熒光特征顯示采用BoNT/A重鏈干預的動物，脊髓損傷局部p-GAP 43和SCG 10陽性熒光染色不僅分布于細胞胞漿，同時細胞突起也呈現陽性反應，由此而使細胞突起顯而易見。免疫熒光結果也提示BoNT/A 重鏈干預的脊髓損傷組織，p-GAP 43和SCG 10局部分布特征相似，皆主要以損傷周邊表達增強。由于細胞突起顯而易見，因此，可以認為BoNT/A 重鏈干預脊髓損傷周邊組織內神經突起的長度和數目(圖4)。

3 討論

本研究主要通過單側腰段脊髓損傷基礎上局部和鞘內間斷性給予BoNT/A 重鏈，以此觀察BoNT/A重鏈對脊髓損傷局部生長相關蛋白表達的影響。實驗結果表明，BoNT/A 重鏈可干預脊髓損傷后蛋白表達，對于選擇性生長相關蛋白p-GAP 43和SCG 10則具有增強其表達、增加其在神經細胞及其突起內的分布。

與周圍神經系統(PNS)相比，中樞神經系統(CNS)損傷后通常不能再生[17-18]，其原因主要歸結于損傷的成熟CNS處于富含抑制蛋白和糖蛋白的抑制環境。此外，損傷的成熟CNS神經元內在的生長程序的啟動非常有限[7]。因此，作為CNS之一的脊髓發生損傷后的再生修復是非常有限的。大多數SCI患者面臨著神經功能障礙和終身殘疾的問題。因此，通過各種方式激活CNS的內在生長程序[19]、或通過提供一個允許的環境來促進CNS的神經細胞或軸突再生,積極探討促進脊髓損傷后的再生修復的策略和方法是再生醫學的焦點之一。

本實驗中所采納的BoNT/A重鏈為人工重組的多肽鏈，保留了BoNT/A與宿主細胞結合的功能結構。我們前期的體外實驗已經證明，將人工重組的BoNT/A 重鏈加入培養的Neuro-2a細胞內，可促進該細胞神經突起增長、突起數目增多等，具有促神經生長的作用[20-21]。因此可以推論在體應用BoNT/A重鏈時，只要能夠保持重鏈進入體內不被分解、維持有效濃度，則可發揮其在體外類似的促神經突起生長作用。本實驗采用損傷當時局部給予BoNT/A重鏈及術后經腰骶部插管進行鞘內間斷性給藥的方法，盡可能保證將BoNT/A重鏈直接導入損傷局部、維持一定藥物濃度，避免其被外周抗體中和單核吞噬細胞吞噬的結局，可以保證藥物在實驗觀察階段持續有效。因此，此種給藥方法適合用于觀察干預脊髓損傷后再生修復的一些藥物/制劑的長期療效。

損傷軸突的最終成功再生依賴于再生相關基因(regeneration-associated genes, RAGs)及其對應蛋白質在神經細胞內的轉錄和翻譯合成[22]。研究者曾經觀察外周神經損傷早期的細胞體反應時發現，外周神經損傷后所屬神經元的mRNA及其相關蛋白的合成明顯增加，這種反應呈現了損傷后的積極主動的再生修復過程[23-24]，譬如：損傷后軸突特異生長相關蛋白-43(GAP-43)的表達上調被認為積極參與軸突再生[25-26]。除GAP-43外，本實驗中所選擇的另一個生長相關蛋白(頸上神經節蛋白10，SCG 10)亦是參與神經軸突再生的主要結構蛋白。GAP-43主要以磷酸化形式參與成熟神經軸突發芽和再生，在神經損傷時表達上調；而SCG 10，也被稱為STMN蛋白2(STMN2),屬于stathmin家族蛋白，主要參與軸突內的微管動力學和蛋白質轉運[27-28]，是神經軸突再生的標志蛋白之一[29]。本研究之所以選擇GAP-43及SCG 10作為BoNT/A重鏈是是否干預脊髓損傷后再生修復的標志蛋白主要是基于上述兩種蛋白的促神經生長作用，同時還由于二者的分子量恰好位于雙向電泳結果中呈現變化的蛋白點水平范圍內。針對這兩種選擇性性生長相關蛋白的SDS-PAGE及Western Blot 結果顯示：不論p-GAP-43或SCG 10，在單純脊髓損傷時二者的表達均有所增多；不論二者在損傷后隨時間變化的特征有何差異，損傷基礎上的BoNT/A重鏈應用皆可促進二者的表達進一步增強。本研究的實驗結果提示：脊髓損傷后的p-GAP 43和SCG 10的表達增加是脊髓組織對損傷做出的有限再生反應，由于中樞神經系統損傷后局部還有大量的髓磷脂抑制因子的產生及對神經軸突再生的抑制作用，因此單純損傷后的p-GAP 43和SCG 10的表達增加并不能代表神經軸突可以進行有效再生；BoNT/A 重鏈對p-GAP 43和SCG 10表達的進一步促進可以看做是BoNT/A 重鏈在體發揮干預作用的一部分。事實亦是如此，BoNT/A 重鏈對神經細胞的干預作用并不僅限于干預生長相關蛋白的表達。我們同期的實驗研究已觀察到BoNT/A 重鏈可以抑制髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)的表達，并可拮抗MAG促ROCK的磷酸化(另文發表)。

結合本實驗結果可以推斷：在體脊髓損傷后局部給予BoNT/A重鏈通過其促進多種生長相關蛋白的表達等最終發揮其促損傷后神經再生修復的作用。然而，由于本實驗僅僅觀察了BoNT/A重鏈對p-GAP 43 和SCG 10的表達，其對在體CNS(包括脊髓)損傷后更多參與再生修復蛋白的影響尚需進一步的研究。

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