血栓通膠囊對氧糖剝奪/復氧致 HUVEC 細胞緊密連接損傷的改善作用

楊愛玲，武 汀，張天睿，韓 冰，孫建寧，張碩峰*

(1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.哈爾濱珍寶制藥有限公司，哈爾濱 150060)

血栓通膠囊 (xueshuantong, XST)[1]是開發的一種血栓通注射液改良口服制劑，其主要成分為三七總皂苷 (panax notoginseng saponins，PNS)，主要作用是活血祛瘀，通脈活絡。臨床上常用于中風偏癱、胸痹心痛。此課題前期結果顯示，PNS對腦缺血再灌注模型小鼠腦微血管白蛋白滲出有抑制作用。但是，PNS對缺血致血管緊密連接損傷的保護作用及其內在調控機制未見報道，亟待深入研究。因此，本實驗借助Transwell小室，構建HUVEC細胞緊密連接模型，考察PNS對氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/R)致細胞緊密連接損傷的改善，從體外角度考察PNS對缺血致內皮緊密連接損傷的保護作用，探討PNS有效單體成分，為PNS口服制劑的臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

血栓通膠囊原料三七總皂苷，哈爾濱珍寶制藥有限公司提供，為類白色至淡黃色無定形粉末，味苦，微甘，批號20111201，主要單體成分為Rg1(31.1%)、Rb1(33.8%)、Rd(7%)、Re(3.9%)、R1(9.2%)，試驗前用PBS配制。

ECM培養基(1001)，批號19130，Sciencell公司；無糖培養基，Gibco 公司；fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kD(FD70S)，批號SLBG0356 V，Sigma公司；Transwell細胞小室，BD公司；Prolong Gold antifade reagent with DAPI(P36941)，批號 1753492，Thermofisher 公司；封閉用正常羊血清ZLI-9022，批號 WK153325，中杉金橋生物技術有限公司；厭氧產氣條，批號 1003976390，BioMerieux公司；厭氧指示條(96118)，批號 1004170150，BioMerieux公司；甲醇，批號20021022，北京化工試劑廠。

1.2 主要儀器

MERS00002電阻儀，由Millipore公司生產；厭氧盒，由BioMerieux公司生產；圓形細胞爬片(24孔)，型號WHB-24-CS，WHB 生產；壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺，由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產；電熱恒溫鼓風干燥箱，由黃石市恒豐醫療器械有限公司生產；細胞培養箱，由美國 Revco 公司生產；倒置顯微鏡，由德國Leica 公司生產；臺式低溫離心機，由北京眾益中和生物技術有限公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 內皮間緊密連接電阻

將 HUVEC細胞按照1.0×105/cm2接種于Transwell 24 孔板，上室300 μL培養液，下室700 μL培養基，采用EVOM2電阻儀檢測跨內皮電阻(transendothelial electrical resistance， TEER)值，通過減去空白對照沒有接種細胞小室膜的TEER值，得到該小孔細胞的TEER值。自TEER值即將穩定作為起始開始記錄。

待 Transwell 中內皮細胞培養4 d 達到完全融合，將細胞培養基換成無糖培養基置缺氧箱中缺氧6 h后，換成正常ECM內皮培養基置37℃，5% CO2培養箱中再灌注24 h，檢測TEER值。給藥組設定PNS終濃度為10、20、40 μg/mL；人參皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人參皂苷Rg1 12.44 μg/mL。

1.3.2 內皮細胞間滲透性

將HUVEC按照1.0×105/cm2接種于24 孔板，上室300 μL培養液，下室700 μL培養基，待 Transwell 中內皮細胞培養4 d達到完全融合，開始實驗。

在 Transwell上室中加入終濃度為1 mg/mL FITC-葡聚糖(70 kd)的無糖培養基200 μL，下室加入無糖培養基700 μL，置缺氧盒中缺氧6 h后，以正常 ECM 完全培養基替換無糖培養基，置正常培養箱復氧24 h后，在每個下池取樣品100 μL，置于96孔板中，用多功能酶標儀測定熒光強度，激發波長為490 nm，發射波長為520 nm，檢測滲透到下室FITC-葡聚糖的熒光強度。給藥組設定PNS終濃度為10、20、40 μg/mL；人參皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人參皂苷Rg1 12.44 μg/mL。依據FITC-葡聚糖的熒光強度判斷葡聚糖滲透到外池的量，從而判斷 PNS對緊密連接蛋白的調控。

1.3.3 免疫熒光

取出已固定好的內皮細胞爬片，置常溫甲醇中，移至-40℃固定30 min，取出置室溫10 min，PBS漂洗10 min×3次；加入封閉液，37℃封閉30 min；加入兔抗大鼠ZO-1(1∶100)、claudin-5(1∶100)37℃孵育1 h，PBS漂洗10 min×3次；加入二抗FITC標記羊抗兔以及FITC標記羊抗小鼠，避光，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3 次；加入含DAPI封閉液，避光，室溫孵育5 min，PBS漂洗5 min×2次，30%甘油封片，指甲油固定，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 三七總皂苷及人參皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剝奪致HUVEC細胞電阻值損傷

PNS 20、40 mg/L組能夠顯著抑制模型組緊密連接電阻的降低(模型組，65±5.0 Ω；PNS 20、40 mg/L分別為 95±4.6 Ω、101±6.0 Ω；P< 0.01，P< 0.05)。人參皂苷Rb1能夠顯著升高OGD 6 h復氧24 h后內皮緊密連接電阻(模型組，75±6.4 Ω；Rb1 13.52 mg/L 97±2.0 Ω)。人參皂苷Rg1 對 HUVEC細胞緊密連接電阻值無明顯影響。(見圖1～2)

注：A:正常對照組；B:模型組；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；與模型組對比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1 PNS對氧糖剝奪致HUVEC細胞電阻值損傷改善作用Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.1 Effects of PNS on the transendothelial electrical resistance of HUVEC cells after OGD 6 h/Reox 24 h

注：A:正常對照組；B:模型組；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；與模型組對比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 人參皂苷Rb1、Rg1對氧糖剝奪致HUVEC細胞電阻值損傷改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 Effects of Rb1 and Rg1 on the transendothelial electrical resistance (TEER) of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.2 三七總皂苷及人參皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剝奪致HUVEC細胞滲透性損傷

PNS 20、40 mg/L組能夠顯著抑制內皮細胞滲透性的升高(正常對照組，0.082±0.00；模型組，0.097±0.01；PNS 20、40 mg/L分別為 0.085±0.00，0.086±0.01；P< 0.01)。人參皂苷Rb1能夠顯著抑制OGD 6 h復氧24 h后內皮細胞滲透性的升高(正常對照組，0.083±0.00，模型組，0.10±0.01；Rb1 13.52 mg/L 0.087±0.00)。人參皂苷Rg1 對 HUVEC細胞滲透性增加無明顯影響。(見圖3～4)

注：A:正常對照組；B:模型組；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；與模型組對比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 三七總皂苷對氧糖剝奪致內皮細胞滲透性損傷的改善作用Note.Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.3 Effects of PNS on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

注：A:正常對照組；B:模型組；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；與模型組對比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖4 人參Rb1、Rg1對氧糖剝奪致內皮細胞滲透性損傷的改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL. Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.4 Effects of Rb1 and Rg1 on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.3 三七總皂苷及其單體對氧糖剝奪/復氧復糖致 HUVEC 細胞緊密連接蛋白損傷的改善作用

正常組HUVEC 細胞的ZO-1及claudin-5蛋白主要分布于臨近細胞膜，排列連續，顯示出內皮細胞的典型鋪路石排列。缺氧6 h復氧24 h損傷后，細胞邊緣的緊密連接蛋白顯著減少，環形結構斷裂，甚至消失，細胞核內緊密連接蛋白呈增加趨勢。PNS 20、40 mg/L及Rb1 13.52 mg/L組可觀察到細胞間緊密連接局部恢復。PNS 10 mg/L、Rg1 12.44 mg/L組沒有觀察到明顯變化。(見圖5～6)

3 討論

血管內皮細胞間緊密連接(tight junction，TJ)是維持粘血管通透性和機械屏障的重要結構[2-5]：緊密連接調節著離子和大分子物質的跨細胞旁路的被動轉運，只允許離子及小分子可溶性物質通過，而不允許毒性大分子及微生物通過。內皮細胞間緊密連接一旦發生變異、減少或缺失，血管通透性就會增加，細菌、內毒素及大分子物質就可通過緊密連接進入體循環。因此，緊密連接在血管屏障功能中的作用至關重要，闡明其分子結構及調控機制，對認識屏障功能及防治相關疾病的發生具有重要意義。

體外內皮屏障功能的研究中，內皮細胞電阻和內皮滲透性是評價體外細胞緊密連接形成與否的黃金指標。細胞間連接構成了循環細胞及大分子物質從血液到組織的重要屏障，穩定了血管內液體的膠體滲透壓，維持血管張力，允許血漿和循環的白細胞的選擇性通過，確保生理功能的正常，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接。其中，緊密連接是腦微血管內皮細胞間主要連接方式，構成血管屏障的結構功能基礎。Transwell，又稱為細胞小室，已廣泛用于細胞共培養、細胞侵襲、細胞遷移和細胞趨化方面的研究，較好地模擬了血腦屏障、腸粘膜屏障、胎盤屏障、腹透屏障及視網膜屏障等生物屏障。本實驗借助Transwell小室，構建HUVEC細胞緊密連接模型，考察了PNS對氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/Reox)致細胞緊密連接損傷的改善情況，并探討了PNS有效單體成分。

Shimotake等[6]發現蛋白C的活化能夠通過上調血管緊張素1及其受體Tie2的表達，抑制 HUVEC 內皮通透性的增加，上調緊密連接 ZO-1的表達。以往研究顯示，PNS 50、100 mg/L可抑制β-淀粉樣蛋白42所致BalB/c小鼠微血管內皮細胞活力降低，上調ZO-1蛋白的表達[7]；PNS 25、50、100 mg/L能夠抑制鋁暴露24 h致腦微血管內皮細胞BalB/c細胞基因及蛋白的表達的降低。本實驗結果顯示，PNS 20、40 mg/L可以顯著抑制OGD致HUVEC內皮細胞電阻的降低，抑制OGD致HUVEC內皮細胞 FITC-葡聚糖的滲出，顯著促進OGD損傷后緊密連接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合，發揮對缺氧缺糖誘導下內皮屏障功能損傷的保護作用。PNS 10 mg/L對OGD 致HUVEC 緊密連接損傷沒有顯著影響。楊麗鹍等[8]、 Chen等[9]采用MCAO致腦缺血再灌注損傷模型小鼠，觀察到人參皂苷 Rb1 能夠顯著降低術后48 h腦水腫增加，降低伊文思藍的滲出，并通過降低 MMP-9以及NOX4的表達上調緊密連接蛋白ZO-1、occludin 的表達。本實驗結果顯示，人參皂苷Rb1能夠顯著抑制OGD致HUVEC內皮電阻的降低，抑制OGD致HUVEC內皮細胞 FITC-葡聚糖的滲出，并能夠促進OGD損傷后緊密連接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合。

注：a：正常對照組；b：模型組；c：三七總皂苷10 mg/L組；d：三七總皂苷20 mg/L；e：三七總皂苷40 mg/L；f：人參皂苷Rb1 13.52 mg/L；g：人參皂苷Rg1 12.44 mg/L。圖5 三七總皂苷及其單體成分人參皂苷Rb1、Rg1對氧糖剝奪致HUVEC 細胞的ZO-1蛋白的改善作用(免疫熒光染色，Bar=100 μm)Note.a：Control group.b：OGD 6 h/Re 24 h group.c：PNS 10 mg/L group.d：PNS 20 mg/L group.e：PNS 40 mg/L group.f：Rb1 13.52 mg/L group.g：Rg1 12.44 mg/L group.Fig.5 Effects of PNS and Rb1/Rg1 on ZO-1 in HUVEC cells after OGD 6 h/R24 h treatment. Immunofluorescence staining.

注：a：正常對照組；b：模型組；c：三七總皂苷10mg/L組；d：三七總皂苷20mg/L；e：三七總皂苷40mg/L；f：人參皂苷Rb113.52mg/L；g：人參皂苷Rg112.44mg/L。 圖6 三七總皂苷及其單體成分人參皂苷Rb1、Rg1對氧糖剝奪致HUVEC細胞的Claudin-5蛋白的改善作用(免疫熒光染色，Bar=100μm) Note.a:Controlgroup.b:OGD6h/Reox24hgroup.c:PNS10mg/Lgroup.d:PNS20mg/Lgroup.e:PNS40mg/Lgroup.f:Rb113.52mg/Lgroup.g:Rg112.44mg/Lgroup. Fig.6 EffectsofPNSandRb1/Rg1onclaudin-5intheHUVECcellsafter OGD6h/Reox24htreatment.Immunofluorescencestaining

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