TRPV4受體對血管緊張素II誘導的小鼠腎損害的影響

閆鳳娜，劉素曉，崔 琳，謝世陽，沈 思，朱明軍，王幼平*

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，中心實驗室，鄭州 450000； 2.河南中醫藥大學中西醫結合臨床學科，鄭州 450008)

除糖尿病外，高血壓是導致腎損害的另一個最重要的危險因素[1]。筆者以往通過相關研究已經證實以單核/巨噬細胞浸潤為主要特征的炎癥反應在高血壓所誘導的腎損害過程中發揮著重要作用[2]。瞬時受體電位香草酸亞型4(transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4)受體主要表達在心臟、血管內皮以及腎等組織，它可以被多種物理因素(如：高溫和機械刺激)及化學因素(如：內源性大麻素和花生四烯酸)等激活[3]。已有大量報道指出，TRPV4受體的活化可以增強多種炎癥反應[4-5]。因此，本研究擬在血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)所誘導的高血壓小鼠模型上，通過利用TRPV4基因敲除(TRPV4-/-)小鼠探討TRPV4受體對該過程所誘導的腎損害的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性C57BL/6野生型小鼠32只，體重20～24 g，8～9周齡，購自北京維通利華動物有限公司[SCXK(京)2015-0011]。TRPV4-/-小鼠由美國密執根州立大學提供，且其與C57BL/6小鼠回交6代以后所產生的雄性TRPV4-/-小鼠34只，體重20～24 g，8～9周齡。實驗在河南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室進行[SYXK-00015172]，并且所有研究均遵循該醫院實驗動物倫理審查委員會相關規定(倫理審查編號：YFYDW2015012)。

1.2 主要試劑

Ang II(美國Sigma公司)；改良Jaffe肌酐測定試劑盒(美國BioAssay System 公司)；ELISA尿蛋白測定試劑盒(美國Exocell公司)；尿8-異構前列腺素試劑盒(美國Cayman Chemical公司)；羥脯胺酸檢測試劑盒(美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模

本實驗小鼠分為假手術組(野生型假手術組和TRPV4-/-型假手術組)和Ang II處理組(野生型Ang II處理組和TRPV4-/-型Ang II處理組)。根據以往研究報道的方法[6]，建立Ang II誘導的高血壓小鼠模型。具體操作如下：經過1周的適應性飼養以后，經皮下注射甲苯噻嗪(4 mg/kg)和氯胺酮(80 mg/kg)混合麻醉劑麻醉小鼠，且于頸背部皮下包埋miniosmotic pump(Alzet model 1004, Durect Corp, Cupertino, CA, 美國)后，分別連續灌注生理鹽水或Ang II(1 μg/kg·min)，共持續4周。假手術組小鼠灌注生理鹽水，Ang II處理組小鼠灌注Ang II。手術后，對所有小鼠連續3 d注射青霉素鈉鹽。本實驗共觀察4周。

1.3.2 動脈收縮壓的檢測

本研究利用Tail-cuff體積描記法測定手術前以及手術后各周各組小鼠的尾動脈收縮壓，具體操作方法如前所述[7]：上午10:00～12:00，取各組小鼠，待其安靜后，置于28℃～32℃溫箱內加熱10 min，然后，采用固定器對其固定，利用BP-2000型血壓測定儀(購自美國Visitech System公司)連續測定小鼠尾動脈收縮壓5次，最后取5次測定的平均值作為動脈收縮壓值。

1.3.3 尿液及血液的分析

實驗處理開始后第26天，分別取各組實驗小鼠，置于代謝籠內，收集其24 h 尿液，并稱體重。然后，對小鼠行皮下注射氯胺酮(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(4 mg/kg)混合麻醉劑麻醉小鼠，經腹主動脈采集血液，靜放后，于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集血清后放置于-80℃冰箱中保存。分別采用特異性試劑盒測定尿液中8-異構前列腺素的含量，ELISA試劑盒測定尿液白蛋白的含量，以及改良的Jaffe肌酐檢測試劑盒檢測血清中的肌酐濃度。

1.3.4 腎組織病理學分析

取各組小鼠右腎后，稱重，以4%的多聚甲醛對其進行固定，石蠟包埋，并且制備為4 μm厚的組織切片。然后，分別采用過碘酸-雪夫反應(PAS)與Masson三色法對組織切片進行染色。為了保證實驗的客觀性，由一位不了解實驗設計的病理學人員，根據我們已報道的方法[8]，分別進行腎小球硬化指數和腎小管間質損傷分數的半定量分析，從而評估腎小球硬化和腎小管間質損傷程度，具體方法如下：針對腎小球硬化指數，通過PAS染色，在×400倍條件下，每只小鼠隨機選取50個腎小球，根據腎小球硬化范圍進行評分。0分：腎小球無硬化；1分：腎小球硬化范圍≤25%；2分：腎小球硬化范圍≤25%～50%；3分：腎小球硬化范圍≤50%～75%；4分：>75%。最后，腎小球硬化指數為腎小球分數乘以該分數所累積的腎小球百分率之和。針對腎小管間質損傷分數，通過Masson染色，在×200倍條件下，每只小鼠隨即選取20個視野，根據損傷范圍進行評分。0分：無損害；0.5分：損害非常局限；1分：損害范圍<10%；2分：損害范圍為10%～25%；3分：損害范圍為25%～75%；4分：損害范圍>75%。最后，取平均值為腎小管間質損傷分數。

1.3.5 腎膠原含量分析

本研究采用羥脯胺酸測定試劑盒確定腎組織膠原水平的含量。腎樣本的處理如前所述[9]。采用比色法測定羥脯胺酸的含量，且制作羥脯胺酸的標準曲線，依據標準曲線計算羥脯胺酸含量。本實驗假設羥脯胺酸占膠原蛋白平均含量的13.5%。最終實驗數據以每毫克干重中膠原的微克數表示。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠血壓的變化

如圖1所示，實驗處理前各組小鼠之間基礎血壓并沒有明顯差異(WT sham group： 103±6 mmHg；TRPV4-/-sham group：107±7 mmHg；Ang II-treated WT group：107±6 mmHg； Ang II-treated TRPV4-/-group：101±6 mmHg；P> 0.05)。實驗處理后，野生型以及TRPV4-/-型假手術組小鼠的血壓平穩，沒有發生明顯的改變。但是，經過Ang II處理后的兩組小鼠從處理后第一周開始血壓便出現明顯升高(Ang II-treated WT group：153±5 mmHg；Ang II-treated TRPV4-/-group：147±5 mmHg)，與相應的假手術組小鼠組比較(WT sham group：106±5 mmHg；TRPV4-/-sham group：103±5 mmHg)，其差異有顯著性(P< 0.05)，并且其于術后3、4周時達到峰值，然而，經Ang II處理的野生型小鼠和TRPV4-/-小鼠血壓之間的差異無顯著性(3周：Ang II-treated WT group：164±6 mmHg vs. Ang II-treated TRPV4-/-group：170±6 mmHg；4周：Ang II-treated WT group：174±8 mmHg vs. Ang II-treated TRPV4-/-group：168±8 mmHg；P> 0.05)。

注：與野生型假手術組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術組比較，#P< 0.05。圖1 各組小鼠收縮壓的改變Note.*P< 0.05, compared with the WT sham group; #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group.Fig.1 Changes of systolic blood pressure in the groups

2.2 各組小鼠尿白蛋白、8-異構前列腺素排泄量及血清肌酐的變化

如圖2所示，與相應的假手術組比較(尿白蛋白：WT sham group：4.1±0.8 μg/24 h； TRPV4-/-sham group：4.8±1.1 μg/24 h；尿8-異構前列腺素：WT sham group：0.35±0.25 ng/24 h；TRPV4-/-sham group：0.31±0.24 ng/24 h；血清肌酐：WT sham group：0.41±0.06 mg/dL；TRPV4-/-sham group：0.49±0.08 mg/dL)，經Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠24 h尿白蛋白排泄量(Ang II-treated WT group：54.6±8.4 μg/24 h；Ang II-treated TRPV4-/-group：25.2±9.4 μg/24 h)以及尿8-異構前列腺素的排泄量(Ang II-treated WT group：2.59±0.31 ng/24 h； Ang II-treated TRPV4-/-group：1.04±0.33 ng/24 h)均出現明顯增加(P< 0.05)，同時伴有血清肌酐明顯增加(Ang II-treated WT group：1.24±0.15 mg/dL；Ang II-treated TRPV4-/-group：0.88±0.14 mg/dL；P< 0.05)。然而，TRPV4基因敲除后，由 Ang II所誘發的上述改變受到明顯的抑制，其差異有顯著性(P< 0.05)。

注：與野生型假手術組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖2 各組小鼠尿白蛋白(A)、尿8-異構前列腺素(B)以及血清肌酐(C)的變化Note.*P< 0.05, compared with the WT sham group.#P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group.?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.2 Changes of urinary albumin (A), urinary 8-isoprostane (B) and serum creatinine (C) in the groups

2.3 各組小鼠腎臟組織病理學的變化

如圖3所示，與相應的假手術組比較(WT sham group：0.08±0.05；TRPV4-/-sham group：0.12±0.07)，經Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠腎小球均出現明顯的局灶性硬化，其硬化程度呈現顯著增高的現象(Ang II-treated WT group：1.78±0.29；Ang II-treated TRPV4-/-group：1.01±0.22；P< 0.05)，而TRPV4基因敲除能夠明顯抑制由Ang II所誘導的腎小球硬化現象(P< 0.05)。另外，如圖4所示，與相應的假手術組比較(WT sham group：0.18±0.05；TRPV4-/-sham group：0.14±0.05)，經Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠中腎小管出現明顯的肥厚、擴張，以及間質纖維化現象，其損傷程度明顯增加(Ang II-treated WT group：3.20±0.37；Ang II-treated TRPV4-/-group：1.96±0.32；P< 0.05)。但是，TRPV4基因敲除能夠明顯抑制由Ang II所誘導的上述腎小管間質損傷現象(P< 0.05)。

2.4 各組小鼠腎膠原蛋白含量的變化

如圖5所示，與相應的假手術組比較(WT sham group：6.37±1.32 μg/mg干組織；TRPV4-/-sham group：7.16±1.29 μg/mg干組織)，經Ang II處理的野生型小鼠和TRPV4-/-小鼠腎膠原蛋白含量均有明顯的升高(Ang II-treated WT group：21.83±2.41 μg/mg干組織；Ang II-treated TRPV4-/-group：13.80±2.29 μg/mg干組織；P< 0.05)，而TRPV4基因敲除能夠顯著抑制上述由Ang II所引起的腎膠原蛋白水平的升高，其差異有顯著性(P< 0.05)。

3 討論

本實驗結果顯示，皮下注射Ang II所誘導的高血壓能夠造成小鼠腎功能及腎病理學損害，上述損害主要表現為24 h 尿白蛋白與8-異構前列腺素排泄量增加、血清肌酐升高，以及腎小球纖維樣硬化與腎小管間質損傷程度加重、腎膠原蛋白沉積等多個方面。但是，TRPV4基因敲除能夠明顯抑制上述由Ang II所誘發的腎損傷。因此，上述研究結果提示激活TRPV4受體能夠促進Ang II所誘導的腎損害。

注：A：各組小鼠腎PAS染色(×400)；a：野生型假手術組；b：TRPV4-/-型假手術組；c：野生型Ang II處理組；d：TRPV4-/-型Ang II處理組。B：各組小鼠腎小球硬化指數變化；與野生型假手術組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖3 各組小鼠腎臟中腎小球硬化程度的變化Note.A: Representative PAS-stained kidney sections in the all groups (×400). a: WT sham group. b: TRPV4-/- sham group. c: Ang II-treated WT grou. d: Ang II-treated TRPV4-/- group. B: Changes in glomerulosclerosis index in all groups. *P< 0.05, compared with the WT sham group.#P< 0.05, compared with the TRPV4-/- Sham group.?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.3 Glomerulosclerotic changes in the groups

注：A：各組小鼠腎Masson染色(×200)；a：野生型假手術組；b：TRPV4-/-型假手術組；c：野生型Ang II處理組；d：TRPV4-/-型Ang II處理組；B：各組小鼠腎小管間質損傷分數變化；與野生型假手術組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖4 各組小鼠腎中腎小管間質損傷程度的變化Note.A: Representative Masson trichrome-stained kidney sections in the groups (×200). a: WT sham group. b: TRPV4-/- sham group. c: Ang II-treated WT group. d: Ang II-treated TRPV4-/- group. B: Changes of tubulointerstitial injury scores in the groups. *P< 0.05, compared with the WT sham group. #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group. ?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.4 Changes of tubulointerstitial injury in the groups

注：與野生型假手術組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖5 各組小鼠腎臟膠原蛋白含量的變化Note.*P< 0.05, compared with WT sham group. #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group. ?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.5 Changes of collagen levels in kidneys in the groups

我們知道，血壓升高是造成腎損害的主要機制之一[10]。通過對小鼠尾動脈收縮壓的檢測及分析，我們發現皮下注射Ang II能夠在小鼠誘發高血壓，而TRPV4基因敲除可以減輕和緩解由高血壓所誘導的腎損害。但是，TRPV4基因的敲除并不影響Ang II所誘發的高血壓。因此，我們推測，在Ang II所誘發的腎損害過程中，TRPV4基因敲除所表現出的腎保護作用并不是通過降低血壓來實現的，即TRPV4受體促進Ang II所誘導的腎損害的機制是獨立于血壓因素的。

眾所周知，尿白蛋白是反映腎疾病嚴重程度的重要指標之一。本研究發現皮下注射Ang II能夠在小鼠中造成明顯的白蛋白尿。然而，我們通過光學顯微鏡證實腎小球的損害程度并非與尿白蛋白相一致，這與以往的報道相一致[11]，即尿白蛋白的增加先于光學顯微鏡下腎損害的發生，這是由于導致白蛋白尿的腎超微結構的改變先于光學顯微鏡下腎組織形態學的改變[12]。TRPV4基因敲除對于由Ang II引起的尿白蛋白有顯著的抑制作用，然而，TRPV4受體對Ang II所誘發的腎超微結構損傷的影響還有待于進一步研究闡明。

目前，盡管高血壓造成腎損害的具體機制尚不清楚，但是，大量研究已證實氧化應激反應在此過程中發揮著重要作用[13,14]。在高血壓的發生和發展過程中，活性氧(reactive oxygen stress, ROS)的增加可導致腎發生炎癥反應和相關損害。在病理狀態下，ROS可以氧化多種細胞成分，其中包括細胞膜和DNA等，從而給機體組織帶來損傷。8-異構前列腺素作為氧化應激反應的產物，其水平通常用來反映氧化應激反應的程度。本研究結果顯示，在Ang II造成腎損害的過程中，尿中8-異構前列腺素的排泄量顯著增加，從而反映出腎氧自由基水平的增高。另外，TRPV4基因敲除后，上述反應顯著減弱，該研究結果提示TRPV4受體通過促進氧化應激反應加劇Ang II所誘導的腎損害。

TRPV4受體主要表達于血管內皮細胞，它的活化可以增強以單核/巨噬細胞浸潤為主的炎癥反應[3]。腎損害的發展過程可以表現在多個方面，其中包括腎小管間質中炎性細胞的浸潤和膠原蛋白的沉積等[15]，該病理過程引起腎纖維化，最終導致腎衰竭。為了探討TRPV4受體在腎損害中的作用，我們檢測了腎膠原蛋白的含量，結果發現，在TRPV4基因敲除小鼠，由皮下灌注Ang II所導致的腎膠原沉積水平的增高程度較野生型小鼠明顯下降，該結果表明TRPV4受體可以明顯促進腎纖維化，而該病理變化最終可引起腎的嚴重損傷。

本實驗研究結果顯示，通過皮下注射Ang II可以誘發明顯的腎損傷，而在此過程中，TRPV4受體發揮著重要作用。在Ang II所誘導的高血壓過程中，TRPV4受體通過增加氧自由基的產生促進腎損害的發生和發展。因此，針對高血壓所誘導的腎損害，我們的研究結果提示TRPV4受體可能成為防治該損害的重要分子生物學靶點。

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