響應面法優化超聲輔助提取藍靛果多糖的工藝研究

韓春然，張家成，王 鑫，那治國，2，王佳寧，謝靜南，張 凱

（1.哈爾濱商業大學，高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江東方學院，黑龍江哈爾濱 150066）

藍靛果忍冬（Lonicera enulis Turcz） 簡稱藍靛果，屬被子植物門，忍冬科，忍冬屬。藍靛果原產于北半球溫帶地區，隨后被引入世界各國種植培育，如今在中國、俄羅斯、日本及朝鮮等絕大多數亞歐地區都有藍靛果的種植與開發。我國對藍靛果的研究相對其他發達國家起步晚。起初，我國主要致力于研究關于野生藍靛果的資源調查和人工栽培這2個方面；近年來，隨著對野生藍靛果開發利用的研究逐漸深入，在生態學特性、器官解剖、分類、地位等一系列研究上，我國學者取得了較大進展。藍靛果果實不僅富含礦物質、各類氨基酸、維生素等營養物質，而且還含有大量的花色苷、黃酮、多酚等對人體有益的活性物質[1-5]。這些物質都對人體健康具有促進作用，使藍靛果具有較高的藥用功能和保健價值[6-8]。

張雁南等人[9]的研究發現微波輔助提取法中，體積分數為65%無水乙醇提取出的藍靛果紅色素可以清除自由基，從而起到抗氧化作用。王恩福等人[10]研究發現，通過注射高脂食物使大鼠患有試驗型高血脂，發現乙酸乙酯所提取的藍靛果提取物可以使大鼠體內密度脂蛋白和血清中超氧化物歧化酶的含量增加，而甘油三酯和血清中丙二醛的含量明顯減少，表明該物質對高脂大鼠具有一定的降脂功效。劉奕琳等人[11]采用細胞凋亡的試驗研究表明，藍靛果花色苷在一定條件下對人體肺癌細胞、肝癌細胞和宮頸癌細胞均有很強的抑制作用，其安全無毒和極佳的生理功效，已經使多糖成為一類具有開發價值的新型藥物資源[12]。一系列的研究表明，多糖具有提高機體免疫力、預防疲勞、降血糖、降血脂、抗癌、抑菌、防輻射等生理功效[13]。現階段，大量的動植物多糖已經被成功開發利用，如大棗、南瓜多糖[14-15]、殼聚糖等。藍靛果中含有較為豐富的多糖，是一種良好的提取原料。目前，對藍靛果的研究集中在花色苷的提取、純化及功能性研究，對藍靛果多糖的研究還是空白。所以，優化藍靛果多糖的提取工藝，對深入研究其功能性及系列產品的開發利用具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 原料與試劑

藍靛果，黑龍江勃利縣采摘；硫酸、苯酚、乙醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司提供；快流速DEAE-瓊脂糖凝膠，北京博奧拓達科技有限公司提供。

KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；UV-9100型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產品；HL-2B型數顯恒流泵，上海精科實業有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒質量的葡萄糖標準品250 mg置于250 mL的容量瓶中，加水適量使其溶解、定容。精密吸取上述溶液25 mL，定容至250mL容量瓶中，即得100μg/mL的標準樣品。用移液槍精密移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的葡萄糖標準溶液分別置于試管中，定容至1 mL，分別加1.0 mL的6%苯酚，搖勻迅速滴加濃硫酸5mL，搖勻，在室溫下冷卻30 min，以空白校正零點。

1.2.2 多糖含量的測定

吸取提取出的樣品溶液，根據上述操作，測定樣品溶液的吸光度，將其帶入回歸方程，以計算多糖的含量。公式如下：

式中：C——樣液的濃度；

V——定容后的體積；

0.934——藍靛果多糖/總糖轉換系數；

m——所取藍靛果粉末的質量；

n——稀釋倍數。

1.2.3 超聲輔助提取條件優化

挑選果實成熟、果肉飽滿的藍靛果，干燥、粉碎。稱取2.00 g（準確稱量至±0.01 g） 的粉碎后的藍靛果粉末，按1∶15的料液比取蒸餾水溶解藍靛果粉末于燒杯中，后置于一定溫度（30，40，50，60，70℃）的超聲清洗器水浴中浸提一定時間（20，40，60，80，100 min），并設置超聲波清洗器功率（150，175，200，225，250W）。取1mL稀釋后的提取液，加入1mL苯酚，5mL硫酸，冷卻至室溫，在波長490 nm下測定吸光度A。計算藍靛果多糖濃度。

1.2.4 響應曲面分析

選取超聲溫度、超聲時間、超聲功率3個因素用Design-Expert 7.0.0進行Box-Behnken試驗[16]。

Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

如圖1所示，以葡萄糖質量濃度（μg/mL） 為橫坐標，于波長490 nm下吸光度（A） 為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：Y=0.014 6X+0.002 1（R2=0.998 4）。

2.2 超聲輔助提取條件優化分析

2.2.1 超聲時間對提取率的影響

在料液比1∶15，超聲溫度40℃，超聲功率175 W的提取條件下分別提取20，40，60，80，100min，在490 nm下測定吸光度A，通過標準曲線定量并計算。

超聲時間對提取率的影響見圖2。

從圖2可以看出，當超聲時間在20～60 min時，吸光度隨超聲時間的延長而增加，即提取的藍靛果含量隨超聲時間的延長而增加；繼續隨著超聲時間的延長吸光度呈下降趨勢，即藍靛果多糖的提取量呈下降趨勢。從圖2可以看出，超聲時間在60min時吸光度最高，即超聲時間60min時藍靛果多糖得率最大。由此可得，最佳的超聲時間為60min。

圖2 超聲時間對提取率的影響

2.2.2 超聲溫度對提取量的影響

在超聲時間60 min，超聲功率175 W，料液比1∶15的提取條件下分別用30，40，50，60，70℃的超聲溫度進行提取；在490 nm下測定吸光度，通過標準曲線定量并計算。

超聲溫度對提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對提取率的影響

從圖3可以看出，當超聲溫度在30～40℃時，吸光度隨超聲溫度的升高而增加，即提取的藍靛果多糖含量隨超聲溫度的升高而增加。這是由于藍靛果中的多糖能溶解到溶劑中，升高溫度使溶劑對多糖的提取能力增大（分子擴散作用），加快了提取速率，進而增加單位時間的提取量[17]。在超聲溫度為40℃時，吸光度達到最大，即所提取的藍靛果多糖含量最高。當超聲溫度高于40℃時，吸光度隨超聲溫度的升高而降低并趨平，即所提取的藍靛果多糖含量開始下降。由此可得，最優提取溫度為40℃。

2.2.3 超聲功率對提取量的影響結果

在超聲時間60 min，超聲溫度40℃，料液比1∶15的提取條件下分別用 150，175，200，225，250W的功率進行提取；在490 nm下測定吸光度。

超聲功率對提取率的影響見圖4。

從圖4可以看出，當超聲功率在150～175W時，吸光度隨超聲功率的升高而而增加，即提取的藍靛果多糖含量隨超聲功率的升高而增加。這是由于功率增大能加劇空氣泡的運動，當超聲功率增加時，多糖提取率有所上升。在超聲功率為175W時，吸光度達到最大，即所提取的藍靛果多糖含量最高。當超聲功率高于175W時，吸光度隨超聲功率的升高而降低，即所提取的藍靛果多糖含量開始下降。由此可得，最佳超聲功率為175W。

圖4 超聲功率對提取率的影響

2.2.4 響應曲面分析結果

Box-Behnken試驗設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表2中的數據通過Design Expert軟件進行擬合分析，藍靛果多糖提取率與3個變量之間的關系表述為以下二階多項式方程。

利用Design Expert軟件對表2數據進行多元回歸擬合，獲得超聲輔助提取藍靛果多糖對超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）和超聲功率（X3）的二次多項回歸模型方程為：

響應面模型方差分析見表3，回歸方程系數顯著性檢驗見表4。

從表3可見，試驗所選用的模型高度顯著（p＜0.000 1），模型的校正決定系數R2adj=0.972 1，說明該模型能解釋97.21%響應值的變化；相關系數R=0.993 9，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的，可以用此來分析超聲輔助藍靛果多糖的提取。從表4回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型一次項X1，X2，交互項X1X2，X1X3顯著；二次項 X12，v22，X32極顯著；X3，X2X3不顯著。

表3 響應面模型方差分析

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

超聲溫度與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖5。

圖5 超聲溫度與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

由圖5可以看出，在超聲功率為最佳值時，超聲溫度與超聲時間的交互作用對藍靛果多糖得率產生了顯著性影響。從等高線可以看出，隨著超聲溫度和超聲時間的增加，多糖得率也在增長；但超聲溫度大于40℃，超聲時間大于60 min后，超聲溫度和超聲時間的增加會導致藍靛果多糖得率的下降。

超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖6。

圖6 超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

由圖6可以看出，當超聲溫度為最佳條件時，超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖的得率有顯著影響。藍靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲時間的增加而增長，在超聲時間60 min，超聲功率175W時得率到達最大值，隨后藍靛果多糖得率隨超聲功率和超聲時間的增加而降低。

超聲功率與超聲溫度對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖7。

由圖7可以看出，當超聲時間為最佳條件時，藍靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲溫度的增加而增長，在超聲時間60 min，超聲溫度40℃時得率到達最大值，隨后藍靛果多糖得率隨超聲功率和超聲溫度的增加而降低。

由回歸方程解得中心點的最佳解為超聲時間67.17min，超聲溫度41.36℃，超聲功率175.08W，預測最大提取得率24.263%。

調整預測最佳提取參數，超聲時間67 min，超聲溫度41℃，超聲功率175W。在該條件下進行驗證試驗，所得結果為24.324%，模型與實際沒有顯著差異。

3 結論

圖7 超聲功率與超聲溫度對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

以干燥后的藍靛果為原料，通過熱水浸提法，在單因素試驗的基礎上，利用響應面優化試驗設計，探究超聲輔助提取藍靛果多糖的最佳工藝條件。單因素試驗選取超聲時間、超聲溫度和超聲功率3個因素進行研究，并設計三因素的響應面試驗。結果表明，單因素試驗中的最佳條件為超聲時間60min，超聲溫度40℃，超聲功率175W；通過響應面法得到最終提取工藝為超聲時間67min，超聲溫度41℃，超聲功率175 W，在此條件下藍靛果多糖得率為24.324%，與預測值相近，表明響應面法優化的提取條件可行。

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