纖維素酶提取楮實子多酚及其抗氧化性研究*

任歡歡 馬 花 石鵬霞 武 澤王江麗 陳澤林 張 繼**

（1 西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州730070 2 甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心 甘肅蘭州 730070）

楮實子（Fructus Broussonetiae），桑科植物構樹的成熟果實，又名構果、野楊梅等［1］，是一種常見的中藥材，常生長在湖南、湖北、甘肅等地［2］。現代藥理進一步研究表明：楮實子在促進記憶、降血脂、調節免疫及抗氧化等方面也有很好的功效［3-5］。

近年來，國、內外對楮實子天然有效成分的研究多集中在黃酮、色素、多糖、皂苷及楮實子油等方面，對楮實子多酚的研究鮮有報道。本實驗選用纖維素酶法提取楮實子多酚，以單因素實驗結果為依據，采用Box-Behnken 實驗設計和Design－Expert 8.0.6 響應面軟件分析優化了楮實子多酚提取工藝，并對楮實子多酚提取液的抗氧化活性進行了初步研究，為楮實子的開發利用提供相關的理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 成熟楮實子，采自甘肅省隴南市成縣。纖維素酶（5 萬U/g，北京索萊寶科技有限公司），福林酚（AR，北京索萊寶科技有限公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（簡稱DPPH，AR，天津市大茂化學試劑廠），抗壞血酸（簡稱Vc，AR，天津市大茂化學試劑廠），鐵氰化鉀（簡稱為K3［Fe（CN）6］，AR，天津市光復科技發展有限公司），沒食子酸（AR，上海中秦化學試劑有限公司），三氯乙酸（簡稱TCA，AR，天津市凱信化學工業有限公司），其余試劑均為實驗室常用分析純試劑。

1.2 儀器與設備 RE-52AA 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），JD500-3 電子天平（沈陽龍騰電子有限公司），UV9100B 紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 楮實子多酚的提取方法

1）單因素實驗。實驗設計如表1（下頁）所示。

2）楮實子多酚提取工藝的優化。

在單因素實驗結果的基礎上，選取影響楮實子多酚提取的主要因素浸提時間、液料比、浸提溫度及pH 為考察變量，選取楮實子多酚提取率為評價指標，采用Design Expert 8.0.6 設計響應面優化試驗，實驗設計見表2。

表2 響應面實驗因素水平

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 楮實子多酚含量的測定 依據福林酚法［6］略作修改：吸取0.50 mL 楮實子多酚提取液，補加0.50 mL 蒸餾水，加入0.20 mL 福林酚試劑混勻，靜置3～8min，再加1 mL 飽和碳酸鈉溶液，補水至5 mL，充分混勻，室溫避光處理60 min 后在波長760 nm 處測其吸光度。以沒食子酸為標樣，制作標準曲線，所得標準曲線方程為Y=1.9338X+0.0391（R2=0.9992），式中：Y 為OD 值，X為沒食子酸濃度。根據該方程可求出提取液中楮實子多酚質量濃度（mg/mL），再根據公式（1）即可求出楮實子多酚的提取率。

表1 纖維素酶提取楮實子多酚單因素實驗

式中：c 為待測液中多酚的質量濃度（mg/mL）；V 為待測液體積（mL）；N 為稀釋倍數；M 為楮實子質量（g）。

1.3.2.2 抗氧化活性的測定

1）多酚提取液的準備。準確稱取2 g 楮實子果渣后用優化后的工藝條件提取楮實子多酚，濾液濃縮后定容至適當體積，吸取不同體積懸蒸液配制成不同質量濃度進行抗氧化活性測定。

2）DPPH 自由基清除能力的測定。測定方法借鑒陳晨等［7］的方法，按下列3 組進行實驗（DPPH乙醇溶液濃度為20 mmol/L）：

A.2 mL 不同質量濃度樣品+2 mL DPPH 乙醇溶液；

B.2 mL 不同質量濃度樣品+2 mL 無水乙醇；

C.2 mL 無水乙醇+2 mL DPPH 乙醇溶液。

以上3 組處理分別充分混勻，黑暗處理30 min于517 nm 處測吸光度。采用VC作為對照組，每組重復3 次，取其平均值。DPPH 自由基清除能力的計算方法如公式（2）所示：

式中：Aa為a 組實驗在517 nm 處的吸光度；Ab為b 組實驗在517 nm 處的吸光度；Ac為c 組實驗在517 nm 處的吸光度。

3）還原能力的測定。依據法［7］略 作 修 改：取0.50 mL 不同質量濃度的樣品溶液，分別加入1.25 mL pH 6.60 的PBS 緩沖液和1.25 mL 0.01 g/mL 的K3［Fe（CN）6］溶液，充分混勻，50℃水浴，20 min 后冷卻至室溫，加入1.25 mL 10% TCA混勻，靜置10 min，后各自取上清液1.25 mL，加入1.25 mL 蒸餾水和1.25 mL 0.01 g/mL 的FeCl3混勻，靜置10 min 后于700 nm 波長處測吸光度。采用VC作為對照組，每組重復3 次，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 楮實子多酚提取的單因素實驗

2.1.1 纖維素酶含量對楮實子多酚提取率的影響 從圖1中可以看出，當纖維素酶含量在0.05~0.25 mg/mL 時，隨著酶含量的增加，多酚提取率不斷增大，當酶用量超過0.25 mg/mL 時，多酚提取率又開始下降。這是因為隨著酶含量的增加，纖維素酶與楮實子果實顆粒的作用點越來越多，增加了酶解速率，提高了多酚的溶出，當酶用量過大時，過多的酶會堆積而包裹住楮實子果實顆粒，阻礙多酚的傳質［8］。因此，最佳的纖維素酶含量選擇為0.25 mg/mL。

2.1.2 浸提時間對楮實子多酚提取率的影響從圖2可看出，楮實子多酚提取率在120 min 時達到最大值，在120 min 以后，提取率反而出現下降的趨勢。該變化規律表明浸提時間越長，被分解或被氧化的楮實子多酚則越多，致使楮實子多酚提取率降低［9］。因此，考慮提取效果及成本等因素，選取120 min 作為浸提時間。

2.1.3 液料比對楮實子多酚提取率的影響 由圖3可知，隨液料比增大，多酚提取率逐漸增大，在30∶1 mL/g 達到最大值后開始減小。原因可能是隨液料比的增大，溶劑和楮實子果渣的接觸面積增大，使多酚的提取率隨之增加；繼續增大液料比，胞內的其他天然產物大量溶出（如多糖）［10］，阻礙了多酚的提取。故液料比選擇為30∶1 mL/g。

2.1.4 浸提溫度對楮實子多酚提取率的影響圖4表明，在30～60℃范圍內，楮實子多酚的提取率呈上升趨勢；在60～80℃范圍內，其提取率則呈下降趨勢。這可能是升高溫度促進了纖維素酶活性，也促進了提取液中分子的運動，更利于多酚的溶出；繼續升高溫度，楮實子多酚的提取率下降，可能是纖維素酶的活性受到了抑制，也可能與高溫引發多酚發生其他副反應有關［11］。所以，選取浸提溫度為60℃。

2.1.5 pH 對楮實子多酚提取率的影響 由圖5可知，當pH＜6.00 時，楮實子多酚提取率隨著pH 值的增大而顯著提高； 當酶解液pH=6.00時，楮實子多酚提取率達到最大值；當pH＞6.00時楮實子多酚提取率隨著pH 值的增大而下降，說明酶活力受pH 值的影響，不僅能夠影響酶的構象，還影響底物的解離狀態［9］。因此將浸提pH值設定為6.00。

2.2 響應面法優化楮實子多酚的提取工藝

2.2.1 Design Expert 8.0.6 設計及實驗結果 以Design Expert 8.0.6 的中心組合實驗設計原理和單因素實驗結果為實驗設計依據，選取浸提時間、液料比、 浸提溫度以及pH 設計4 因素3 水平的響應面分析方法，優化楮實子多酚的提取工藝參數。設計及實驗結果見表3。

表3 響應面實驗設計結果

表4 模型方差分析

2.2.2 回歸模型的建立與分析 表3實驗數據利用Design Expert 8.0.6 軟件對其進行分析，得回歸方程：

Y=35.07+3.28A+3.23B+2.16C+2.29D-0.14AB-2.27AC-0.04AD-4.81×10-3BC-1.81BD+0.86CD-0.05A2-1.04B2-2.54C2-1.52D2

通過回歸模型分析響應面的回歸參數（表4）。由表4可知，模型P＜0.0001，說明該模型極顯著；失擬項P=0.5211＞0.05，失擬項不顯著； 一次項（A、B、C、D）、二次項（C2、D2）、交互項（AC、BD）的P值都小于0.05，說明該因素對楮實子多酚的提取效果有顯著影響。通過以上數據可看出，該模型擬合程度良好，可以用此模型來描述各提取條件與楮實子多酚提取率之間的關系。

由回歸方程經分析可得出，浸提時間、 液料比、浸提溫度、和pH 4 個因素對楮實子多酚提取率的影響從大到小的順序依次是： 浸提時間＞液料比＞pH＞浸提溫度。

2.2.3 雙因素交互作用分析 本試驗建立的模型中AC（浸提時間與浸提溫度）、BD（液料比與pH）的交互項達顯著水平。固定2 個因素在0 水平上，研究另2 個因素間的交互作用。根據所作的三維空間曲面圖，分析浸提時間與浸提溫度、液料比與pH 的交互作用對楮實子多酚提取率的影響。

圖6是浸提時間和浸提溫度對楮實子多酚提取率交互影響的響應曲面圖。當液料比30∶1 mL/g，pH6.00 時，浸提時間一定，楮實子多酚提取率隨浸提溫度的增大呈現先增大、 然后又趨于平緩的變化規律；當浸提溫度一定時，楮實子多酚提取率與浸提時間也有同樣的變化規律。

液料比和pH 對楮實子多酚提取率的交互影響的結果如圖7所示。當浸提時間120 min，浸提溫度70℃時，液料比一定，隨著pH 的變化，楮實子多酚提取率呈先升高、趨于平緩后又逐漸減小的變化趨勢；當pH 一定時，楮實子多酚提取率隨液料比的增加也呈先升高趨于平緩后又逐漸減小的變化趨勢。

2.2.4 優化提取參數和驗證模型 經分析得纖維素酶提取楮實子多酚的最佳條件是： 浸提時間150 min、 液 料 比35 ∶1 mL/g、 浸 提 溫 度70℃及pH6.07。理論最佳提取率為40.39 mg/g。為了驗證該實驗是否可行，采用優化后的實驗條件進行楮實子多酚提取的驗證實驗，同時考慮到實際操作的可控性，因此將楮實子多酚提取的實驗條件修訂為：浸提時間150 min、液料比35∶1 mL/g、浸提溫度70℃、pH6.10。經過5 次平行實驗，得到的楮實子多酚的實際提取率為39.67mg/g。

表5 最優條件與最優條件下的預測、實際值

2.3 楮實子多酚的抗氧化性實驗

2.3.1 楮實子多酚對DPPH 自由基的清除能力圖8顯示了不同質量濃度的楮實子多酚提取液與同一質量濃度的VC 溶液清除DPPH 自由基的能力關系。在0.20 mg/mL 以前，增加質量濃度，其清除率也顯著增大；當質量濃度達到0.20 mg/mL 時，楮實子多酚的清除率隨濃度的增加而趨于平緩。該變化規律與白茶茶多酚、多花勾兒茶果實和葉多酚對DPPH 自由基清除率的影響規律一致［12-13］。VC溶液在質量濃度0～1.00 mg/mL 范圍內變化趨勢雖與楮實子多酚提取液的一樣，但其對DPPH 自由基的清除能力明顯強于楮實子多酚提取液。

2.3.2 楮實子多酚的還原能力 圖9是不同質量濃度的楮實子多酚提取液與相同質量濃度VC溶液的還原能力圖。由圖可看出，楮實子多酚提取液的還原能力明顯弱于等質量濃度的VC溶液。兩者在0～1.00 mg/mL 的質量濃度范圍內均呈現出還原能力隨質量濃度的升高先顯著增強后逐漸趨于平緩的變化規律。

3 結論

1）本實驗以楮實子為原料，通過單因素實驗和響應面優化實驗并考慮到實際情況的可控性，得到楮實子多酚的最佳提取條件為： 浸提時間150 min、液料比35∶1 mL/g、浸提溫度70℃、pH 6.10。經過5 次平行實驗，得到的實際平均提取率為39.67 mg/g。2）由回歸方程分析可得出，對楮實子多酚提取率的影響從大到小依次是：浸提時間＞液料比＞pH＞浸提溫度。3）通過2 種體外抗氧化評價試驗（DPPH 自由基清除力和鐵氰化鉀還原法），可證實楮實子多酚具有較強的自由基清除能力及還原能力。