質譜法研究氣相中18—冠醚—6與氨基酸的非共價相互作用

吳若菲

摘 要 利用電噴霧電離質譜研究了在氣相條件下18冠醚6與20余種天然氨基酸及其異構體間的非共價相互作用。定性結果表明，在氣相中18冠6可以與氨基酸形成化學計量比為1∶1的非共價復合物。配制一系列不同濃度的18冠6分別與固定濃度的氨基酸反應，利用質譜測得反應物和產物的質譜峰， 計算冠醚分別與L苯丙氨酸、L酪氨酸、L賴氨酸和L天冬氨酸反應的復合物結合常數lgKa分別為3.90、 3.75、 4.06和3.64， 基于此建立了校準曲線。通過競爭反應實驗，以上述4種氨基酸與冠醚復合物的結合常數為參考值，可推算得到其余氨基酸與冠醚的結合常數。實驗結果表明，冠醚氨基酸復合物的穩定性與氨基酸的種類相關，節堿性氨基酸以及側鏈是烷基（或氫原子）的氨基酸對冠醚的親和性更好， 而酸性氨基酸（如L絲氨酸）以及側鏈上有酰胺鍵的氨基酸，對冠醚的親和性較低。 研究了18冠6對L型氨基酸及其D型異構體的手性選擇性，結果表明，18冠6只能識別部分中性氨基酸。

關鍵詞 18冠醚6； 氨基酸； 電噴霧電離質譜； 非共價相互作用

1 引 言

1967年，杜邦公司的Pedersen[1，2]在實驗室首次合成了一種新的大環聚醚化合物，這類化合物主要由-CH2CH2O-的重復單元組成，由于其形狀酷似皇冠，所以被統稱為冠醚。典型的冠醚及其衍生物如圖1所示，冠醚的命名原則通常采用Pedersen法[1]。例如1，4，7，10，13，16六氧環十八烷C12H24O6（圖1a），可稱為18冠醚6（簡寫成18冠6或18c6）。

冠醚外層親脂而內層親水，其空腔可由不同的合成方法被調控，因此，它能夠選擇性地與金屬陽離子或其它小分子絡合[3，4]。此外，冠醚衍生物還可以手性識別和分離某些對映體化合物[5，6]。如今，冠醚的應用涉及生物化學、能源等多個領域，包括離子選擇性電極、離子活化與抑制、色譜手性固定相、大環液晶、相轉移催化劑、膜轉運離子載體等[7～10]。

近年來，由于冠醚與蛋白質或多肽等生物大分子中的某些氨基酸殘基如賴氨酸殘基的特異性結合非共價相互作用日益受到人們的關注，這種結合使得冠醚可以作為蛋白質的結構探針，即冠醚具有潛在的分子識別作用[11]。 在進行以非共價方式加合蛋白質的探針實驗[12～13]時，冠醚類化合物可與蛋白質上的賴氨酸殘基的側鏈相結合。Stedwell等[14]通過紅外多光子解離技術研究了冠醚與質子化氨基酸形成的復合物，紅外光譜圖顯示NH+3中NH伸縮振動的紅移比較明顯，表明NH+3與冠醚間的相互作用相當穩定。Chen等[15]通過導向離子束串聯質譜（GIBMS）及理論計算，對18冠6與5種氨基酸分別形成的復合物進行研究，發現冠醚與氨基酸的結合常數隨其質子親和性增強而減小。研究冠醚與各種氨基酸間結合作用的強弱，對于冠醚在多肽藥物的篩選，以及冠醚在靶向藥物方面的應用都具有積極意義。但目前尚未見對冠醚和常見氨基酸的非共價作用進行系統性定性和定量分析的文獻報道。

近年來，隨著質譜技術迅速發展， 電噴霧質譜已經成為研究非共價復合物一種強有力的工具 [16，17]。本研究在以18冠6為代表，采用電噴霧電離質譜法（ESIMS）研究冠醚對20種L型天然氨基酸的非共價作用，用質譜滴定法定量測定18冠6分別與20種L或D型氨基酸的結合常數，探討不同氨基酸的氨基端、羧基端和側鏈對復合物結合強度的影響，同時用簡易的方法探索了18冠6對氨基酸對映體的手性選擇性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

電噴霧電離質譜（ESIMS）儀器為API3000型質譜儀（SCIEX公司），質量精度由聚丙二醇（PPG）校準，實驗氣體均為99.99%的高純氮氣。

18冠6（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；甘氨酸（Glycine，Gly）、L賴氨酸（Lysine，Lys）、L精氨酸（Arginine，Arg）、L組氨酸（Histidine，His）、L丙氨酸（Alanine，Ala）、L苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、L色氨酸（Tryptophan，Trp）、L纈氨酸（Valine，Val）、L亮氨酸（Leucine，Leu）、L異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、L脯氨酸（Proline，Pro）、L蛋氨酸（Methionine，Met）、L酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、L絲氨酸（Serine，Ser）、L蘇氨酸（Threonine，Thr）、L半胱氨酸（Cysteine，Cys）、L天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、L天冬酰胺（Asparagine，Asn）、L谷氨酸（Glutamic acid，Glu）和L谷氨酰胺（Glutamine，Gln）及它們的D型異構體（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%）。

2.2 實驗方法

ESI正離子模式，電噴霧電壓為4.5 kV，進樣速率為3 μL/min。實驗中，所有溶劑均為甲醇水體系（1∶1，V/V，含有0.1%甲酸），pH=3.6。

3.3 結合常數的計算

將不同濃度的18冠6與LPhe混合，使得混合后18冠6的濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mmol/L，氨基酸的濃度為0.10 mmol/L。由一級質譜圖和式（1）、（2）、（3）可以得到表1。

采用同樣方法可以得到冠醚分別與LTyr、LLys和LAsp及與其D型異構體間的結合常數（表2）。結合圖4可知，定性分析結果與定量計算結果相符。以LAsp、LLys、LPhe和LTyr為第一客體，分別繪制校準曲線（表3）。

LPro與冠醚的結合常數（lgKa=3.17）較低，可能的原因在于N端的剛性結構使其不易與冠醚結合。酸性氨基酸中，LGlu與冠醚的結合常數（lgKa=4.01）大于LAsp（lgKa=3.64），因為LGlu側鏈上的羰基離N端氨基較遠，吸電子效應更低。在中性氨基酸中，LSer和LThr對冠醚的親和力也較低，推測是N端氨基上的氮原子與側鏈的羥基上的氧原子間形成了分子內氫鍵[19]、導致質子化的氨基難以進攻冠醚；LAsn或LGln與冠醚的結合常數是20種氨基酸中最低的，可能因為它們的側鏈上具有吸電子的酰胺。endprint

此外，測量和計算方法也會對氨基酸跟冠醚的結合常數的大小產生影響。Chen等[15]的實驗結果表明，在堿性氨基酸中，LLys對18冠6的親和性最強，故LLys殘基的側鏈是冠醚與蛋白質或多肽類物質結合時的有效位點；Gly對冠醚的親和性最強，即比起氨基酸側鏈上的氨基，其N端上的氨基更易與冠醚配位。Chen等[15]認為這是因為18冠6具有三重對稱軸（D3d），且空腔尺寸合適，所以形成了3個NH+ O的氫鍵，而冠醚能使質子化的NH+3穩定存在，即冠醚對NH+3有很好的親和力。Yu等[20]通過熒光滴定法測得的18冠6與Trp的結合常數（lgKa=2.19）低于本研究測得值（lgKa=4.04）。這是因為ESIMS會加強靜電作用，削弱疏水作用，因此通過ESIMS測得的結合常數大于通過熒光法測得值。

總之，因氨基酸側鏈上的基團不同，氨基酸對18冠6的親和性也不同。通常，當氨基酸具有多個NH2基團或不含側鏈時，它對冠醚的親和性會更高。因此，推測NH3+與冠醚的配位方式如圖6所示。

4 結 論

本研究利用ESIMS研究了18冠醚6和20種天然氨基酸之間的非共價相互作用。結果表明，18冠醚6與氨基酸能形成化學計量比為1∶1的非共價復合物。冠醚主要通過與氨基酸上的NH2配位而與其結合，故在L型氨基酸中，側鏈為烷基（或氫原子）的氨基酸、堿性氨基酸對冠醚的親和性更強。同時，實驗也表明冠醚僅能識別部分中性氨基酸及其異構體。

擬在本研究基礎上， 繼續研究冠醚與特定的多肽的結合情況，觀察是否符合冠醚與氨基酸的結合規律，也可以探索空腔尺寸不同的冠醚或冠醚衍生物與氨基酸極其衍生物的結合情況，以期為冠醚類化合物在生物制藥篩選等領域的發展提供參考。

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Abstract The noncovalent interactions between 18crown6 （18c6） and 20 common types of protonated amino acids were explored by electrospray ionization mass spectrometry （ESIMS）. The mass spectra showed the formation of 1∶1 stoichiometric noncovalent complexes between 18c6 and amino acids. The calibration curves and linear equations for the complexes of LPhe， LTyr， LLys and LAsp with 18c6 were established by mass spectrometric titration and used as reference values for competitive ESIMS. Through competitive equilibrium， the binding constants for the complexes of 18c6 with other Lamino acids and their Disomers were derived. It was found， as a general trend， lgKa for the complexes of 18c6 with the basic amino acid and the amino acid with alkyl side chain were larger than other complexes， and among the amino acids with alkyl side chain， Gly and Ala exhibited greater 18c6 binding affinities. As for Ser and Thr， the intramolecular hydrogen bond between the nitrogen atom from terminal NH2 and the oxygen atom from carboxyl may impede their protonated aminogroup to attack the 18c6. Furthermore， Gln and Asn exhibited lower 18c6 binding affinities probably due to effects of electronwithdrawing group of acylamide. Finally， the chiral selectivity of 18c6 for 19 L， or Damino acids was measured by ESIMS， indicating 18c6 could only recognize some neutral amino acid isomers.

Keywords 18Crown6； Amino acid； Electrospray ionization mass spectrometry； Noncovalent binding affinity

（Received 5 May 2017； accepted 20 September 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 2011YQ14015006）.endprint