通過脈管相關標志物表達的對比探討術中納米炭甲狀旁腺 負顯影機制*

陳翠花 程若川 趙川 刁暢 蘇艷軍 劉文 潘笑宇

近幾年，臨床上實施甲狀腺手術時，常采用納米炭混懸液顯影示蹤。納米炭是一種具有淋巴趨向性的顯影劑，向甲狀腺腺體內注射時甲狀腺迅速黑染，其引流的淋巴管以及淋巴結黑染，而甲狀旁腺始終保留原色，與黑染的甲狀腺對比呈“負顯影”［1-4］。普遍解釋為甲狀旁腺與甲狀腺各自有一套解剖上互不相通的淋巴系統［1，3-4］。然而，在后續的臨床觀察中發現向甲狀旁腺腺體內注射納米炭混懸液，甲狀旁腺僅局部黑染，甲狀腺不被黑染。本文提出甲狀旁腺可能存在淋巴系統先天缺失或發育不全之假說。目前，關于組織器官毛細淋巴管形態學的研究，免疫組織化學法為首選方法。有研究提示D2-40、LYVE-1是淋巴管內皮細胞較為特異的標志物，其中D2-40對淋巴管內皮具有更高的特異性［5-6］。CD31、CD34為血管內皮細胞較為理想的標志物［7-8］。因而，本研究采用淋巴管特異性標志物D2-40、LYVE-1檢測淋巴管，血管標志物CD31、CD34檢測血管，通過脈管相關標志物表達的對比，探討甲狀旁腺是否存在淋巴系統以及甲狀腺術中納米炭甲狀旁腺“負顯影”的主要機制。

1 材料與方法

1.1 材料

收集昆明醫科大學第一附屬醫院病理科組織標本62例，包括實施甲狀腺手術時切除的正常甲狀旁腺組織石蠟塊45例，因甲狀旁腺自身病變而手術切除的甲狀旁腺腺瘤組織石蠟塊10例及甲狀旁腺癌組織石蠟塊7例。統計62例石蠟塊的患者的一般資料，包括年齡、性別。本文研究通過昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審查批準（2016倫理L第46號）。10例正常甲狀腺組織標本作為陽性對照組，術中收集正常甲狀腺組織標本（冰凍證實無病變）。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 根據甲狀旁腺病理類型分組正常甲狀旁腺組（n=45）、甲狀旁腺腺瘤組（n=10）、甲狀旁腺腺癌組（n=7）。根據意外切除正常甲狀旁腺在病理組織標本中的位置分組。由病理科資深主任醫師重新閱片，從切片層面按照朱精強等［9］提出的甲狀旁腺分型方法，分為：A型甲狀旁腺（貼近或部分嵌入甲狀腺組織或完全位于甲狀腺組織內）20例；B型甲狀旁腺（貼近淋巴結組織或胸腺組織或位于胸腺組織內）25例。

1.2.2 標本制備 62例甲狀旁腺組織石蠟塊，分別3 μm厚切片再用二甲苯常規脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復等步驟處理；10例正常甲狀腺組織標本經4%甲醛固定、石蠟包埋，取3 μm厚切片等步驟處理。

1.2.3 免疫組織化學染色 將以上組織標本的切片分別進行免疫組織化學染色。免疫組織化學采用SP法，SP通用試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司，嚴格按照SP檢測試劑盒說明書所示步驟操作。所用抗體D2-40、CD31、CD34為工作液（購于福州邁新生物技術開發公司）和LYVE-1（稀釋濃度1:100，購于北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗（選用χ2檢驗或配對χ2檢驗法）。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺與甲狀旁腺脈管陽性率

10例正常甲狀腺組織中，D2-40、LYVE-1分別染色均可見陽性淋巴管，且淋巴管位于甲狀腺濾泡間隙、被膜區或門脈區，呈網狀分布（表1，圖1A），CD31、CD34分別染色均可見陽性血管，分布特點與淋巴管相似。

62例甲狀旁腺組織中：CD31有效染色58例，其中50例可見陽性血管，CD34有效染色60例，均可見陽性血管，且陽性染色的血管呈彌漫或網狀分布；D2-40有效染色59例，其中17例可見陽性的淋巴管；LYVE-1有效染色58例，其中23例可見陽性的淋巴管，且陽性者均表現為全視野下可見的單個或少數棕黃色淋巴管，多局限性分布于脈管區或被膜區，腺體實質內少見（圖1，2）。故難以通過計數淋巴管密度［10］進行比較分析，遂計算脈管特異性標志物的陽性表達率，即甲狀旁腺組織陽性染色淋巴管的比例及陽性染色血管的比例進行比較分析（表1～3）。甲狀旁腺與甲狀腺血管標志物陽性表達率差異無統計學意義（P=0.099），而淋巴管陽性表達率差異具有統計學意義（P＜0.001，表1）。

表1 甲狀旁腺與甲狀腺淋巴管及血管相關標志物陽性表達率的比較

2.2 甲狀旁腺淋巴管特異性標志物的陽性表達率與臨床病理因素的關系

甲狀旁腺淋巴管陽性率與性別（D2-40：P=0.753；LYVE-1：P=0.364）、年齡（D2-40：P=0.089；LYVE-1：P=0.622）無關，與其病理類型相關。正常甲狀旁腺與甲狀旁腺癌的陽性率比較差異具有統計學意義（D2-40：P=0.001；LYVE-1：P=0.044），甲狀旁腺瘤與甲狀旁腺癌的陽性率比較，差異具有統計學意義（D2-40：P=0.005；LYVE-1：P=0.005），而正常甲狀旁腺與甲狀旁腺瘤陽性率比較，差異無統計學意義（D2-40：P=0.920；LYVE-1：P=0.533，表2）。

A型甲狀旁腺與B型甲狀旁腺淋巴管陽性率比較，差異無統計學意義（D2-40：P=0.957；LYVE-1：P=0.536，表3）。

淋巴管特異性標志物D2-40、LYVE-1分別染色甲狀旁腺組織，其淋巴管陽性表達率比較，差異無統計學意義（表4，P=0.286）。

圖1 正常甲狀旁腺及病變甲狀旁腺D2-40染色（IHC×100）

圖2 正常甲狀旁腺組織染色（IHC×200）

表2 甲狀旁腺淋巴管相關標志物陽性表達率與臨床病理變量的關系

表3 甲狀旁腺淋巴管相關標志物陽性表達率與甲狀旁腺分型的關系

表4 甲狀旁腺組織不同淋巴管標記物染色淋巴管陽性表達率比較

3 討論

3.1 甲狀旁腺淋巴管研究分析

甲狀旁腺是體積較小的富含血管的內分泌器官。然而，關于甲狀旁腺是否存在淋巴系統尚無明確定論（見表5）［11～14］。本研究采用淋巴管特異性標志物D2-40、LYVE-1進行檢測，血管內皮標志物CD31、CD34檢測相鑒別。研究發現，甲狀腺組織富含血管和淋巴管，CD31、CD34分別染色均可見陽性表達的血管呈網狀分布；D2-40、LYVE-1分別染色，亦可見陽性表達的淋巴管呈網狀分布。然而，在甲狀旁腺組織中CD31、CD34分別染色，可見陽性表達的血管呈網狀分布，D2-40、LYVE-1分別染色，僅少部分甲狀旁腺可見D2-40和（或）LYVE-1陽性表達的單個或少數淋巴管，且一般位于脈管區或被膜區，大部分脈管管腔結構陰性表達，而該部分脈管結構對應CD31、CD34染色陽性表達。表明甲狀旁腺富含血管，但甲狀旁腺僅小部分存在少數淋巴管。進一步結合臨床病理資料統計分析顯示，甲狀旁腺含有淋巴管的概率與年齡、性別、甲狀旁腺分型無關，與甲狀旁腺發生腺瘤病變無關，而與甲狀旁腺惡性病變有關，且惡性者淋巴管出現概率明顯增高。本研究結果與Garcia等［13］相近，Pezerovic-Panijan 等［12］應用H&E、PAS染色法，在光學顯微鏡下觀察甲狀旁腺微脈管得出的結果與本研究部分結果不一致；另一方面，Jin等［14］采用特異性免疫組織化學法，因研究例數有限其結果與本研究也不一致。有文獻指出［15-16］，本研究采用不同檢測方法和不同標記物檢測同類組織中淋巴管的數量有明顯差別。

3.2 甲狀腺切除術中納米炭甲狀旁腺“負顯影”的主要機制

近年來，臨床實施甲狀腺手術時，常應用納米炭顯影技術識別甲狀旁腺［9］。納米炭為納米級顆粒制成的混懸液，顆粒直徑平均為150 nm，由于毛細血管壁的間隙為30～50 nm，而毛細淋巴管為單層內皮細胞構成，呈疊瓦狀排列，連接松散，存在的間隙達500 nm，且其基膜發育并不完全，故納米炭粒不進入血管而迅速進入淋巴管，并滯留集聚于相應淋巴結，使其著色，達到了示蹤作用，呈現高度的淋巴系統趨向性。本研究組曾在甲狀腺術中應用納米炭對甲狀旁腺保護作用進行系列研究［1，3］，將納米炭混懸液通過甲狀腺淋巴系統擴散，可見甲狀腺、甲狀腺中央區及側方淋巴結迅速黑染，而甲狀旁腺不被黑染呈“負顯影”，可以很好地辨識甲旁腺，考慮其各自為獨立的內分泌器官，有獨立的淋巴系統，因毛細淋巴管網互不相通而使納米炭不能流入甲狀旁腺使其染色。同期，張筱驊等［4］亦有相同發現，但未深入研究。根據本研究結果，甲狀腺實質內具有豐富的淋巴管網，而甲狀旁腺組織僅少數存在淋巴管，且一般位于被膜區或脈管區，呈單個或少數局限性分布，由于本研究尚未證實上述甲狀旁腺陽性染色的淋巴管是否與甲狀腺淋巴管互不相通，本研究認為納米炭甲狀旁腺“負顯影”的解剖機制之一，可能是大部分甲狀旁腺缺乏淋巴管網，僅小部分旁腺存在少數淋巴管，導致納米炭在甲狀旁腺腺體內引流失敗或不暢，而“負顯影”甲狀旁腺。

表5 近16年甲狀旁腺淋巴管研究進展統計表

綜上所述，成人大部分甲狀旁腺可能缺乏淋巴管網，僅小部分旁腺存在少數淋巴管。這可能是臨床上甲狀腺術中納米炭甲狀旁腺“負顯影”的主要原因之一。關于甲狀旁腺淋巴管與臨床病理因素的關系，以及甲狀旁腺淋巴管與甲狀腺淋巴管的交通關系等問題，尚待進一步研究。

致謝：感謝浙江省寧波市醫療中心李惠利醫院甲狀腺外科吳偉主主任，在本中心前期研究時提供數例病變的甲狀旁腺組織標本。

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