慢速冷凍卵裂期胚胎復蘇后培養至囊胚移植的臨床結局分析

莫美蘭，孫青，李觀貴，萬才云，陳培林，黃菊，黃麗施，曾勇，熊風

(深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

胚胎冷凍保存廣泛應用于輔助生殖技術中，主要有慢速冷凍法和玻璃化冷凍法[1]。早期相當長一段時間慢速冷凍法在臨床上廣泛使用，但近幾年隨著玻璃化法的成功發展，逐漸取代慢速冷凍法，成為輔助生殖實驗室最主要的冷凍方法[2]。然而，每個中心的胚胎庫里幾乎都保存有一定數量的早期慢速冷凍胚胎。這些胚胎存在以下特點：慢速冷凍保存、保存年份較長、患者幾近高齡、冷存胚胎數量多等。基于上述特點，為了獲得更優的臨床結局，部分中心主張或者是應患者要求，嘗試將慢速冷凍卵裂期胚胎復蘇后培養至囊胚期，篩選出更具活力的胚胎進行移植。但是，這種移植策略是否能夠有效地改善臨床結局，提高妊娠成功率，尚缺乏相應的文獻報道，尤其是針對保存時間長的慢速冷凍胚胎。本研究對深圳中山泌尿外科醫院生殖中心2013～2016年慢速冷凍胚胎復蘇周期進行回顧性分析，對復蘇后培養至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結局進行對比，為臨床選擇移植策略提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選取2013年1月至2016年12月深圳中山泌尿外科醫院生殖中心慢速冷凍胚胎復蘇周期為研究對象。納入標準：(1)復蘇的胚胎為第3天(D3)卵裂期胚胎；(2)同一患者復蘇的胚胎來自于同一取卵周期。排除混合移植其他周期胚胎的周期。所有患者在被告知囊胚培養與移植的優勢、風險以及慢速冷凍D3胚胎復蘇后移植成功率的基礎上，自主選擇復蘇后培養至囊胚再移植或直接行卵裂期胚胎移植，并簽署相應的知情同意書。根據患者自主選擇的結果，將研究對象分為兩組：卵裂期移植組和囊胚移植組。卵裂期移植組即慢速復蘇后直接行卵裂期胚胎移植，共55個復蘇周期。囊胚移植組即復蘇后繼續培養至囊胚移植，共57個復蘇周期。

二、方法

1.慢速冷凍與復蘇：室溫下胚胎在含20%人血清白蛋白(HSA)(SAGE公司，美國)的改良人輸卵管液(MHTF)(SAGE公司，美國)中沖洗3～5遍，然后依次移至含20%HSA+1.5 M丙二醇、20%HSA+1.5 M丙二醇+0.1 M蔗糖的MHTF中孵育10 min后裝入麥管，再將麥管放入程序冷凍儀(PLANER公司，英國)的支架上。按以下冷凍程序進行冷凍：20℃開始，以1℃/min降至2℃，停留8 min，以2℃/min降至-7℃，停留10 min，植冰，停留5 min，以0.3℃/min降至-30℃，以10℃/min降至-150℃。復蘇胚胎時，在液氮罐中取出麥管，室溫搖晃冷凍麥管40 s；將冷凍麥管放入30℃恒溫水浴箱中，停留20 s；剪斷麥管，將胚胎依次浸入含20%HSA+1.0 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.5 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.2 M蔗糖、20%HSA的MHTF解凍液中各5 min，觀察復蘇胚胎存活情況，復蘇后卵裂球存活率≥50%的胚胎定義為存活胚胎。最后將復蘇后的胚胎移入ART-1029胚胎培養液中(SAGE公司，美國)，待移植或繼續培養。

2.囊胚培養：復蘇后繼續培養采用ART-1029胚胎培養液，培養方式為微滴培養。將復蘇后的胚胎根據不同質量，每個微滴1～3枚胚胎，移至提前平衡好的囊胚培養皿中。放置37℃、5%CO2、5%O2的三氣培養箱中，培養48～72 h后觀察囊胚形成情況，并根據Gardner & Schoolcraft評分標準對囊胚進行質量評估。

3.內膜準備與胚胎移植：對于月經周期正常且排卵規律的患者采用自然周期方案，即根據陰道超聲監測，月經天數≥10 d，優勢卵泡直徑≥14 mm，子宮內膜達到7～8 mm以上，排卵后D3進行卵裂期胚胎、D5進行囊胚移植。月經周期不正常或排卵不規律的患者采用人工周期方案，即月經D3起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4 mg/d×5 d，根據內膜情況調整劑量及天數。15 d后B超監測子宮內膜厚度7～8 mm以上時，肌肉注射黃體酮60 mg/d至移植日。B超介導下行胚胎移植術。

4.觀察指標：分析實驗組胚胎繼續培養的囊胚形成率，兩組患者復蘇后第1次移植周期的種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率及抱嬰率等臨床結局。

三、統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據的統計分析，均數比較采用t檢驗，率的差異性分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、慢速復蘇情況及復蘇后繼續培養的囊胚形成率

根據入選時間及標準，共計入選112個慢速復蘇周期，復蘇卵裂期胚胎853枚，復蘇存活率為72.57%。囊胚移植組共培養囊胚539枚，形成囊胚159枚，囊胚形成率為29.50%，其余未形成囊胚，自然退化或溶解。

二、兩組移植患者基本資料比較

本研究收集的臨床結局是復蘇后第1次移植周期的結局，不考慮重復周期的情況。其中，卵裂期移植組55個復蘇周期中，4個周期因胚胎溶解取消移植，6個為重復周期，剩下第1次移植周期45個。囊胚移植組57個復蘇周期中，1個周期因胚胎溶解取消繼續培養，12個周期無囊胚形成取消移植，2個周期因個人原因取消移植，1個為重復周期，剩下第1次移植周期41個。分析兩組患者基本資料如表1所示。移植時女方年齡、取卵時女方年齡、胚胎平均保存時間、黃體轉化日的內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)。

三、兩組移植患者臨床結局比較

卵裂期移植組移植慢速復蘇D3胚胎119枚，其中優質胚胎比例為58.82%。囊胚移植組移植囊胚57枚，其中優質囊胚的比例為47.37%。兩組患者移植優質胚胎的比例無顯著性差異(P>0.05)，但是卵裂期移植組的平均移植胚胎數顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。卵裂期移植組的種植率稍低于囊胚移植組，但無顯著性差異(P>0.05)。卵裂期移植組與囊胚移植組的臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率、抱嬰率比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

表2 兩組患者移植臨床結局比較 [(-±s)，%]

注：*與卵裂期移植組比較，P<0.05；a3個周期產科結局失訪；b2個周期截至投稿日尚未出產科結局

討 論

近幾年，隨著胚胎培養技術的提高，囊胚培養與移植逐漸成為輔助生殖技術發展趨勢，大家逐漸認識到囊胚移植相比卵裂期胚胎移植而言，具有明顯優勢[3]，包括：(1)對胚胎做進一步篩選和修復；(2)有機會挑選到更具發育潛力的胚胎用于移植；(3)囊胚期胚胎與子宮內膜的同步性更佳，易使胚胎成功種植，并減少移植胚胎數目，減少多胎的發生。因此，一部分生殖中心開始由卵裂期胚胎移植逐步推向囊胚移植，以期獲得更好的臨床結局[4-5]。而且，一部分患者也逐漸對囊胚的優勢有所了解并認同，開始主動選擇囊胚移植，期望獲得更佳的臨床妊娠。早年間慢速冷凍的卵裂期胚胎由于保存時間長、母體年齡大等特點，主觀的臨床預后結局不佳。而且大部分患者可能保存有超過3枚的卵裂期胚胎，為了進一步篩選有發育潛能的胚胎移植，提高單次移植的成功率，復蘇后培養至囊胚移植是最常使用的策略。然而，該策略的有效性尚缺乏相應文章的報道。因此，本研究對我們中心復蘇后培養至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結局進行分析。

本研究納入2013年1月至2016年12月慢速復蘇周期112個，復蘇D3卵裂期胚胎853枚，復蘇存活率為72.57%，與已有報道的慢速解凍復蘇存活率79.10%[6]相當，高于王華等[7]報道的57.69%，低于張寧媛等[8]報道的81.25%。產生差異的原因一方面可能是冷凍胚胎的優胚比例存在差異，另一方面也可能由于冷凍儲存時間的不同。我們中心自2010年開始逐漸由慢速冷凍向玻璃化冷凍方法過渡，本研究中的慢速冷凍胚胎的平均儲存時間超過7年(表1)。同時，本研究也驗證了慢速復蘇存活率遠低于目前廣泛使用的玻璃化冷凍方法[9]。因此，慢速冷凍復蘇后，無可用胚胎、取消移植的比例較高。本研究中卵裂期移植組共有55個復蘇周期，4個周期因胚胎溶解取消移植。囊胚移植組共有57個復蘇周期，1個周期因胚胎溶解取消培養。囊胚移植組培養胚胎539枚，形成159枚囊胚，12個周期因無囊胚形成而取消移植，囊胚形成率為29.50%，遠低于本中心D3新鮮剩余胚胎繼續培養的囊胚形成率55.13%(2016年數據，未發表)以及報道的玻璃化D3冷凍胚胎復蘇后囊胚形成率45.10%[10]和54.7%[11]。但是與唐永梅等[12]2012年報道的復蘇胚胎囊胚形成率32.85%相當，該研究中僅部分卵裂期胚胎采用慢速冷凍-快速復溫法，仍有一部分采用的是玻璃化冷凍解凍法。影響囊胚形成的因素很多，包括培養的卵裂期胚胎的質量、患者年齡、體重指數(BMI)水平、FSH劑量等[13]，這可能也是產生上述差異的原因。

囊胚移植與卵裂期胚胎移植的對比研究很多[14]，2016年Glujovsky等[15]綜述了27項隨機對照試驗(RCT)的研究結果，認為新鮮囊胚移植有更高的臨床妊娠率和活嬰出生率。然而，最新一篇Meta分析入選了12項RCT研究總結提出，囊胚優于卵裂期胚胎移植的證據較弱，尚需要設計更加科學嚴謹的RCT研究證實[16]。Carvalho等[17]2016年最新研究結果又表明，新鮮周期囊胚與卵裂期移植臨床結局存在差異，而復蘇周期中并無這種差異。上述研究表明目前對于囊胚移植還是卵裂期移植尚存在爭議。在本項研究中我們分析復蘇后第1次移植周期的結局，規避多周期患者因素對結果產生的干擾。觀察發現患者移植年齡、取卵年齡、胚胎平均保存時間、黃體轉化日的內膜厚度方面均無顯著性差異。由于胚胎屬性的不同，卵裂期胚胎移植1～3枚，囊胚移植1～2枚，因此，卵裂期胚胎移植組的平均移植胚胎數顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。但是兩組移植胚胎中優質胚胎的比例無顯著性差異(P>0.05)。此條件下，種植率方面，卵裂期胚胎移植組有低于囊胚移植組的趨勢，這與報道的囊胚移植可能具有更高的種植潛能[18]是相符的，但是并未呈現統計學差異(P>0.05)，這可能與本研究中卵裂期胚胎移植組優質胚胎的比例略高于囊胚移植組有關。妊娠率方面，卵裂期移植組的臨床妊娠率為44.44%，略高于囊胚移植組的39.02%，差異無統計學意義(P>0.05)。復蘇后卵裂期移植的臨床妊娠率與王華等[7]報道的39.19%基本一致。王欽等[10]對玻璃化冷凍的D3卵裂期胚胎凍融后培養至囊胚移植的分析結果表明，卵裂期胚胎凍融后培養至囊胚移植可以得到較好的臨床結果，移植周期臨床妊娠率為71.8%，顯著高于對照組的43.9%。妊娠率的差異主要可能是由于患者的平均年齡以及移植胚胎數和胚胎質量的不同。另一方面，與王欽等[10]對玻璃化冷凍胚胎的研究結果不同，本研究中慢速冷凍胚胎復蘇后培養至囊胚，相比直接移植卵裂期胚胎而言，并未見改善臨床結局。這可能是由于入選人群的差異，本研究中冷凍胚胎復蘇移植患者年齡偏大，胚胎保存年份較長，加上慢速冷凍技術本身的局限性，其預后結局可能較差。根據美國生殖醫學會(ASRM)與美國輔助生殖技術協會(SART)實踐委員會共識，預后差的患者囊胚移植并不能改善臨床結局[19]。因此，權衡兩種移植策略，囊胚期移植確實能夠顯著減少平均移植胚胎數，有降低多胎妊娠的可能[15，20]。但是也增加了無可移植胚胎的風險，而且囊胚培養增加患者的經濟負擔[21]。

綜上，早期慢速冷凍的D3卵裂期胚胎復蘇后培養至囊胚移植的策略有利有弊，總體而言對臨床結局的改善不大。各中心需要綜合考慮患者意愿及具體情況，選擇合適的慢速冷凍胚胎復蘇后移植策略。

[1] 蔡學泳，徐陽.人類胚胎冷凍：真的到了由慢速向玻璃化方法過渡的時代?[J].生殖醫學雜志，2012，21：288-292.

[2] 甄璟然，孫正怡.胚胎冷凍及復蘇移植的質量管理[J].生殖醫學雜志，2011，20：101-103.

[3] 薛俠，施文浩，師娟子，等.D5選擇性的單囊胚移植和雙囊胚胎移植妊娠結局比較[J].生殖醫學雜志，2014，23：276-279.

[4] Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Day 3 embryo transfer with combined evaluation at the pronuclear and cleavage stages compares favourably with day 5 blastocyst transfer[J].Hum Reprod，2002，17：1852-1855.

[5] 王雅琴，楊菁，徐望明，等.低等級胚胎囊胚培養及凍融周期移植后臨床結局分析[J].生殖醫學雜志，2015，24：220-224.

[6] 李雅芳，趙煥，羅琛，等.玻璃化冷凍與慢速程序冷凍對人ICSI的D3胚胎的效果觀察[J].廣東醫學，2010，31：464-465.

[7] 王華，趙雅云，蔡婕.玻璃化法與慢速程序法對人第3天胚胎冷凍復蘇效果的比較[J].中國優生與遺傳雜志，2011，19：94-95.

[8] 張寧媛，孫海翔，徐志鵬，等.分裂期胚胎慢速冷凍保存時長對復蘇后臨床結局的影響[J].中國婦幼保健，2015，30：3646-3648.

[9] Rezazadeh Valojerdi M，Eftekhari-Yazdi P，Karimian L，et al.Vitrification versus slow freezing gives excellent survival，post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos[J].J Assist Reprod Genet，2009，26：347-354.

[10] 王欽，劉琳琳，金真真，等.D3卵裂期胚胎凍融后移植與凍融后培養至囊胚移植臨床結局分析[J].中國優生與遺傳雜志，2017：122-124.

[11] 李曉旭，仝麗麗，譚麗.玻璃化冷凍囊胚復蘇移植與玻璃化冷凍胚胎復蘇后繼續培養至囊胚移植的妊娠結局比較[J].新鄉醫學院學報，2015，32：623-625.

[12] 唐永梅，韋繼紅，姚春玲，等.凍融囊胚及凍融胚胎養囊胚后移植的臨床效果分析[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20：125-126.

[13] Braga DP，Setti AS，de Cássia S Figueira R，et al.Patient selection criteria for blastocyst transfers in extended embryo culture programs[J].J Assist Reprod Genet，2012，29：1357-1362.

[14] Papanikolaou EG，Camus M，Kolibianakis EM，et al.In vitro fertilization with single blastocyst-stage versus single cleavage-stage embryos[J].N Engl J Med，2006，354：1139-1146.

[15] Glujovsky D，Farquhar C，Quinteiro Retamar AM，et al.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology[J].Cochrane Database Syst Rev，2016，(6)：CD002118.

[16] Martins WP，Nastri CO，Rienzi L，et al.Blastocyst vs cleavage-stage embryo transfer：systematic review and meta-analysis of the reproductive outcomes[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2017，49：583-591.

[17] Carvalho BR，Barbosa MW，Bonesi H，et al.Embryo stage of development is not decisive for reproductive outcomes in frozen-thawed embryo transfer cycles[J].JBRA Assist Reprod，2017，21：23-26.

[18] Eftekhar M，Aflatoonian A，Mohammadian F，et al.Transfer of blastocysts derived from frozen-thawed cleavage stage embryos improved ongoing pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2012，286：511-516.

[19] Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology.Blastocyst culture and transfer in clinical-assisted reproduction：a committee opinion[J].Fertil Steril，2013，99：667-672.

[20] Khalaf Y，El-Toukhy T，Coomarasamy A，et al.Selective single blastocyst transfer reduces the multiple pregnancy rate and increases pregnancy rates：a pre-and postintervention study[J].BJOG，2008，115：385-390.

[21] Glujovsky D，Farquhar C.Cleavage-stage or blastocyst transfer：what are the benefits and harms?[J].Fertil Steril，2016，106：244-250.