基于HPLC-ECD法與聚類分析的中國白酒品質鑒別

于 靜 孫翔宇 王宏鐳 黃衛東

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院， 北京 100083； 2.北京市產品質量監督檢驗院， 北京 101300)

0 引言

白酒是我國傳統的蒸餾酒，是世界七大蒸餾酒之一[1]。傳統工藝白酒即固態法白酒，是以糧食為原料，采用固態(或半固態)糖化、發酵、蒸餾，經陳釀、勾兌而成，未添加食用酒精及非白酒發酵產生的呈香、呈味物質，具有固有風格特征的白酒[2]。隨著氣相色譜技術的普及和勾兌技術進步，某些白酒企業將液態法白酒通過添加特征香氣成分，利用酒精進行勾兌加工，以酒精勾兌白酒冒充固態法白酒，欺騙消費者[3]。GB/T 15109—2008《白酒工業術語》規定白酒的“勾兌調味”是把具有不同香氣、口味、風格的酒，按不同比例進行調配，使之符合一定標準，保持成品酒特定風格的專門技術[2]，目的是為了保證白酒的風格，而不是簡單的酒精勾兌。固態法白酒與液態法白酒的標準主要區別是酒精度、總酸、總酯等理化指標的差異，白酒的分級也是通過檢測上述指標的含量來判定，按照現行的檢測指標，不能區分白酒的品質[4-5]。

目前白酒質量標準對白酒質量的表述主要包括：感官指標、理化指標及衛生指標。其中理化指標、衛生指標對白酒中常量或半微量的理化成分及對人體有害的成分進行了規定，并有相應的檢測方法。感官品評是指評酒者運用眼、鼻、口等感覺器官對白酒樣品的色澤、口味及風格特征進行分析、評價和判斷。感官指標雖然也有檢測方法，但要靠人的感覺器官，因個體存在差異，易受環境的影響，導致評價結果的不穩定性[6]。

目前，對于白酒的品質鑒別有大量的報道，氣相色譜法[7]、電子鼻[8-9]、原子力顯微鏡[10]、紅外光譜[11-12]、電子舌[13]等均可應用于白酒品質的鑒別。高效液相色譜庫侖陣列電化學檢測法(High performance liquid chromatography-coulometric electrochemical array detection, HPLC-ECD)是一種較新的檢測方法，由于該方法具有較高靈敏度、高選擇性，國外已經在食品、飲料等產品質量和原材料控制，農藥殘留檢測等多個領域得到了廣泛應用[14-19]，并已有在葡萄酒酚類物質測定上的應用[20-21]，而在我國傳統白酒測定的應用，未見相關報道。近幾年，運用HPLC-ECD方法結合化學計量學方法在食品鑒偽和品質鑒別方面有積極的貢獻[22-23]。與此同時，聚類分析是研究樣品分類問題的一種多元統計分析方法。按照分類方法可分為動態聚類法和系統聚類法，系統聚類法提供了強大的變量和樣品分析功能，在聚類分析中應用較廣泛，在白酒質量控制及真偽判別方面已有大量報道[24]。本文首先建立白酒檢測的HPLC-ECD方法，之后運用化學計量學分析法對固態法白酒與酒精勾兌白酒及不同勾兌比例的白酒進行聚類分析，以期建立并拓展HPLC-ECD在我國傳統白酒質量控制與真偽判別的相關方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

建立HPLC-ECD測試方法的固態法白酒與酒精勾兌白酒：本研究樣品為固態法發酵白酒和不同勾兌比例的酒精勾兌白酒。固態法白酒為未經后期勾兌的清香型優級高度白酒，酒精勾兌白酒理化指標達到目前清香型優級高度白酒國標要求，所有測試樣品均為北京市某一知名白酒企業(企業代號H)提供。

模型驗證測試樣品：委托北京4家白酒企業提供符合清香型優級白酒標準的樣品，樣品數量39個，其中24個為固態法白酒，15個為酒精勾兌白酒。具體樣品數量見表1。

表1 白酒模型驗證測試樣品數量Tab.1 Test sample quantity of liquor model verification

不同勾兌比例的白酒樣品：委托北京某一白酒企業(企業代號H)提供符合國家標準中清香型優級白酒標準的樣品，含不同比例固態法白酒的勾兌白酒，共23個樣品，其中含100%固態法白酒數量為6個，含75%固態法白酒樣品數量為6個，含15%固態法白酒樣品數量為5個，含10%固態法白酒樣品數量為6個。

試劑：磷酸二氫鈉(色譜純)，美國Sigma公司；磷酸(色譜純)、北京化學試劑公司；甲醇、乙腈(色譜純)，德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

島津LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)：配二元高壓泵、SIL-20A型自動進樣器、柱溫箱；梅特勒-托利多公司ME204E型電子天平、FE20型pH計。5600A型庫侖陣列電化學檢測器(美國ESA公司)：配備8通道檢測器，檢測器由8個通道順序相連，4個通道為一組，共2組，每組可單獨使用，每一通道都由多空石墨工作電極、鈀參比電極、鉑計數電極組成，每一通道均可獨立施加不同電壓。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido C18(5 μm，250×4.6 mm，120 A)，前置C18保護柱(4.6 mm×5 mm)；流動相：鹽相為0.03 mol/L的磷酸二氫鈉水溶液；有機相為：水、甲醇、乙腈體積比為20∶40∶40，該溶液中加入磷酸二氫鈉，濃度為0.03 mol/L。梯度洗脫的程序：有機相在50 min內，由20%線性升到80%。8通道電壓：-150、300、400、500、600、700、800、900 mV。

電極清洗：為減少電極表面的吸附，每次分析結束后將所有電極電壓設定為1 000 mV并保持5 min。流速：1 mL/min。流動相pH值：6.3。

1.3.2 樣品處理

樣品經過0.22 μm微孔濾膜過濾(聚醚砜)，濾液用于庫倫陣列電化學檢測器高效液相色譜分析。

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，數據用3次獨立數據的平均值±標準偏差表示。數據處理使用ESA軟件，統計數據使用Pirouette軟件。

2 結果與分析

2.1 白酒的庫侖陣列電化學檢測器高效液相色譜檢測方法

HPLC-ECD法檢測白酒樣品，樣品無需前處

理，檢測到的物質無需定性、定量分析，色譜峰為全采集方式。檢測方法優化主要從檢測物質的分離度、數量及含量，方法精密度及方法穩定性確定。首先，根據試湊試驗法[21]，獲得最佳色譜條件，固態法白酒出峰數量102個，各檢測物質分離好，并且峰形尖銳，對稱性好，可滿足白酒中各活性物質的檢測，色譜圖見圖1。同時，在該條件下，為驗證方法的精密度，分別在8個通道選取含量比較高的1種物質進行6次重復試驗，計算結果的標準偏差，穩定性如表2所示，由表可見方法相對標準偏差小于2.39%，滿足試驗對精密度的要求。分別將同一樣品放置0、12、24、48、72 h進行測定，選取上述8通道的數據進行穩定性試驗，結果表明樣品在3 d穩定性良好，相對標準偏差小于2.1%，滿足試驗對穩定性的要求。

圖1 固態法白酒的HPLC-ECD色譜圖Fig.1 HPLC-ECD diagram of Chinese spirits prodiced by traditional fermentation

表2 HPLC-ECD法測試白酒的精密度試驗數據Tab.2 Precision and relative standard deviations of liquor sample

2.2 固態法白酒與酒精勾兌白酒指紋圖譜及聚類結果分析

2.2.1 HPLC-ECD指紋圖譜

本文分析了符合國家清香型優級白酒標準的固態法白酒與酒精勾兌白酒，所分析樣品均為同一企業提供。2種白酒的HPLC-ECD指紋圖譜如圖2所示。

圖2 酒精勾兌白酒與固態法白酒HPLC-ECD色譜圖Fig.2 HPLC-ECD diagrams of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending

首先，兩種白酒理化指標與衛生指標均符合GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》，清香型白酒的特征成分為乙酸乙酯，是發酵過程中產生的主體香氣物質。測試樣品為優級高度白酒，標準要求乙酸乙酯的含量(質量濃度)應在0.60～2.60 g/L范圍內，總酯(以乙酸乙酯計)含量應在1.0 g/L以上[4]。按照GB/T 10345—2007 《白酒分析方法》氣相色譜檢測到白酒中的酯類主要為乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯[25]，這些酯類的含量之和是白酒中總酯含量的主要來源。白酒企業可以通過人工勾兌模擬固態法白酒中酯類的含量，勾兌出符合國家標準要求的產品。依靠傳統的檢測方法不能區分固態法白酒與酒精勾兌白酒。

白酒是一個復雜的體系，除了含有98%(質量分數)的乙醇和水外，還含有2%的微量成分，而正是微量成分決定了白酒香氣、口感和風格。微量成分可分為醇類、酯類、乙酯類、酸類、酮類、酚類、內酯類化合物、硫化物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物以及其他化合物[26]。庫侖陣列檢測器可以檢測到帶有電化學活性的物質，如酚、醛、芳香胺、醌、雜環胺、單胺和硝基胺等，所以應用庫侖陣列高效液相色譜主要檢測的是白酒中帶有電化學活性的物質，這些能夠在電場的作用下，發生氧化還原反應[27]，這些物質在白酒的感官品評中，對人的味覺起作用[28-29]。通過圖2可以看出，固態法白酒和酒精勾兌白酒在HPLC-ECD中檢測到的組分及含量有顯著的差異，固態法白酒的信息峰含量明顯高于酒精勾兌白酒。在相同的數據處理條件下，采集8通道的檢測數據，固態法白酒能獲得102個信息峰，酒精勾兌白酒能檢測到79個信息峰，白酒指紋圖譜信息豐富。白酒指紋圖譜的建立旨在識別固態法白酒與酒精勾兌白酒并為白酒的質量控制提供有效的手段。已有報道采用HPLC-ECD法可獲得山茱萸的指紋圖譜，方法簡單、準確，可用于山茱萸的質量控制[17]。

2.2.2 相同企業提供的白酒樣品聚類分析結果

本文采用Pirouette分析軟件中的系統聚類法分析相同企業提供的16個白酒樣品的HPLC-CECD數據，其中6個樣品為固態法白酒(G-H)，10個樣品為酒精勾兌白酒(Y-H)。經過統計軟件分析后生成的聚類分析樹狀圖見圖3。

圖3 固態法白酒與酒精勾兌白酒聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending

從圖3可以看出，當酒樣品被分為兩類時，第1大類為固態法白酒，第2大類為酒精勾兌白酒。聚類分析法能準確區分固態法白酒與酒精勾兌白酒。當酒樣被分為3類時，固態法白酒保持不變，被分為一類，酒精勾兌白酒被分為兩類，這可能是由酒精勾兌的基酒及人為勾兌過程中添加的物質不同導致的。本文選取HPLC-ECD法檢測白酒的8通道檢測數據進行聚類分析，該方法無需對檢測到的數據進行定性定量分析，采集的是白酒在譜圖中的全部樣品信息，很難通過人工調配進行模擬，該方法的建立為白酒的品質控制及真偽鑒別提供解決的途徑。有報道采用聚類方法分析不同香型白酒中的揮發性物質，鑒別不同香型的白酒，并發現一定的規律[24,30]。

2.2.3 不同企業提供的白酒樣品聚類分析結果

本文采用Pirouette分析軟件中系統聚類法分析北京市4家白酒企業提供的39個樣品的HPLC-ECD數據，其中24個樣品為固態法白酒(G-H)，15個樣品為酒精勾兌白酒(Y-H)。經過統計軟件分析后生成的聚類分析樹狀圖見圖4。

圖4 4家白酒企業提供固態法白酒與酒精勾兌白酒聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending provided by four liquor companies

從圖4可以看出，4家白酒企業提供的酒樣品被分為兩類時，第1大類為固態法白酒，第2大類為酒精勾兌白酒，但組間的差距相比同一企業提供的白酒樣品小。不同品牌的白酒樣品大部分能聚成一類，但也有小部分聚成不同類，如Y-L-1，不同企業生產的白酒因選取的原料、制曲工藝、發酵條件、蒸餾條件、勾兌技術及貯存方式的不同，白酒中微量物質種類和含量有所不同，導致白酒風格迥異[28]。聚類分析法能夠正確區分不同白酒企業提供的相同香型的固態法白酒與酒精勾兌白酒，但不能準確區分不同品牌同一香型的白酒。2.2.4 不同勾兌比例白酒指紋圖譜及聚類分析結果

圖5 不同勾兌比例白酒色譜圖Fig.5 Chromatograms of liquor with different blending proportions

圖6 不同酒精勾兌比例白酒聚類分析樹狀圖Fig.6 Cluster analysis of liquor with different alcohol blending proportions

GB/T 20822—2007《固液法白酒》中規定，固液法白酒的定義為以固態法白酒(不低于30%)、液態法白酒勾調而成的白酒[31]。其中對固液法白酒的含量做出明確的規定，但現行的檢測標準不能實現固液法白酒中固態法白酒含量的測定。本文分別選取含有不同比例的固態法白酒樣品進行HPLC-ECD檢測，建立不同勾兌比例的白酒鑒別模型。選取白酒樣品中固態法白酒的體積分數分別為10%、15%、75%和100%，4種比例的白酒樣品HPLC-ECD色譜圖見圖5，聚類分析結果見圖6。

從圖6可以清楚地看出，不同勾兌比例白酒樣品的分類。當樣品被分為兩類時，第1大類是含固態法白酒75%、100%的樣品，第2大類是含固態法白酒10%、15%的樣品。當樣品被分為4類時，第1類是含固態法白酒100%的樣品，第1類是含固態法白酒75%的樣品，第3類是含固態法白酒15%的樣品，第4類是含固態法白酒10%的樣品。結果表明運用HPLC-ECD檢測白酒，結合聚類分析方法能夠實現不同勾兌比例白酒的鑒別，建立的鑒別方法能夠為質監部門的白酒監管工作提供技術支持。

3 結束語

建立了白酒的高效液相電化學檢測方法，在最優色譜條件下，8通道能采集固態法白酒中102個信息峰，各物質得到了很好的分離，精密度、穩定性高。使用該方法對固態法白酒與酒精勾兌白酒進行分析，發現能夠檢測到白酒中多種活性物質，指紋圖譜信息豐富，兩種白酒圖譜差異明顯。同時，運用聚類分析對檢測數據處理，能實現準確區分固態法白酒與酒精勾兌白酒。運用該方法同時檢測不同企業提供的白酒樣品，檢測結果表明，該方法能夠準確區分相同香型的固態法白酒與酒精勾兌白酒，但不能準確區分不同品牌的白酒。進一步分析不同勾兌比例的白酒，聚類結果與實際相符，白酒樣品被準確分為4類：固態法白酒體積分數分別為10%、15%、75%和100%。

1 沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業出版社，2007.

2 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. 白酒工業術語：GB/T 15109—2008[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

3 劉宏宇.白酒品質鑒別方法探究[J]. 科技創業家, 2014(7)：228.

4 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. 清香型白酒：GB/T 10781.2—2006[S]. 北京：中國標準出版社，2006.

5 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.液態法白酒：GB/T 20821—2007[S]. 北京：中國標準出版社，2007.

6 姜安, 彭江濤, 彭思龍, 等.酒香型光譜分析和模式識別計算方法[J]. 光譜學與光譜分析, 2010,30(4):920-923. JIANG An, PENG Jiangtao, PENG Silong, et al. Analysis of liquor flavor spectra and pattern recognition computation[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2010,30(4):920-923. (in Chinese)

7 張曉磊, 饒靜, 李春揚, 等.氣相色譜與氣質聯用技術在白酒質量控制中的應用[J]. 釀酒, 2016, 43(2): 16-23. ZHANG Xiaolei, RAO Jing, LI Chunyang, et al. Applications of gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry in quality control of Chinese liquor [J]. Liquor Making, 2016, 43(2):16-23. (in Chinese)

8 殷勇, 白玉, 于慧春, 等.電子鼻鑒別白酒信號小波去漂移方法[J/OL].農業機械學報, 2016, 47(11): 219-223. http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?flag=1&file_no=20161130&journal_id=jcsam.DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2016.11.030. YIN Yong, BAI Yu, YU Huichun, et al. Drift elimination method of electronic nose signals based on wavelet analysis and discrimination of white spirit samples[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2016, 47(11): 219-223. (in Chinese)

9 鄒小波, 趙杰文, 殷曉平, 等. 嗅覺可視化技術在白酒識別中的應用[J].農業機械學報, 2009, 40(1): 110-113. ZOU Xiaobo, ZHAO Jiewen, YIN Xiaoping, et al. Chinese liquors identification by olfaction visualization technology[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2009, 40(1): 110-113. (in Chinese)

10 趙金松, 張敬雨, 許愿. 原子力顯微鏡在中國白酒品質鑒別中的應用[J]. 釀酒科技, 2014(10): 55-56. ZHAO Jinsong, ZHANG Jingyu, XU Yuan. Application of atomic force microscopy in quality identification of Chinese baijiu (liquor) [J]. Liquor-Making Science & Technology, 2014(10): 55-56. (in Chinese)

11 呂海棠, 任彥蓉, 李春花. 紅外光譜技術對濃香型和清香型白酒的品質分析[J].中國釀造, 2010, 29(10): 175-177. Lü Haitang, REN Yanrong, LI Chunhua. Quality analysis of Luzhou-flavor liquor and Fen-flavor liquor with IR spectroscopy [J]. China Brewing, 2010, 29(10): 175-177.(in Chinese)

12 楊國強，張淑娟，趙艷茹.基于近紅外透射光譜的汾陽王酒快速鑒別[J/OL].農業機械學報, 2013, 44(增刊1):189-193. http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?flag=1&file_no=2013s134&journal_id=jcsam.DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2013.S1.034. YANG Guoqiang, ZHANG Shujuan, ZHAO Yanru. Fast discrimination of adulterated Fenyangwang wine based on near infrared spectroscopy[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2013, 44(Supp.1): 189-193. (in Chinese)

13 辛松林, 朱楠, 王熙, 等. 基于電子舌和感官評價的中國白酒與雞尾酒基酒的比較研究[J]. 釀酒科技, 2012(7): 35-38. XIN Songlin, ZHU Nan, WANG Xi, et al. Comparative study of Chinese liquor and cocktail base wine based on electronic tongue assessment and sensory evaluation[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2012(7): 35-38. (in Chinese)

14 BLANKA B, TOMAS H. Utilization of coulometric array detection in analysis of beverages and plant extracts[J]. Procedia Chemistry, 2010, 2(1):92-100 .

15 FLORIDI S, MONTANARI L, MARCONI O, et al. Determination of free phenolic acids in wort and beer by coulometric array detection[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 51(6):1548-1554.

16 ACWORTH I N. The application of HPLC with coulometric electrochemical array detection to the study of natural products and botanicals: from targeted analyses to metabolomics[J]. Planta Medica, 2011, 77(12):1248.

17 張延妮,王喆之,杜昱光,等.高效液相色譜-庫侖電極陣列法檢測山茱萸的指紋圖譜研究 [J]. 陜西師范大學學報:自然科學版, 2005, 33(3):75-77. ZHANG Y N, WANG Z Z, DU Y G,et al. Fingerprint analysis ofMacrocarpiumofficinaleby high performance liquid chromatographic coulometric array detection [J]. Journal of Shaanxi Normal University: Natural Science Edition, 2005,33(3):75-77.(in Chinese)

18 NURMI T, TUOMAINEN T P, VIRTANEN J, et al. High-performance liquid chromatography and coulometric electrode array detector in serum 25-hydroxyvitamin D(3) and 25-hydroxyvitamin D(2) analyses [J]. Analytical Biochemistry, 2013, 435(1):1-9.

19 NEGER N, SCHWARTZ-ZIMMERMANN H, SONTAG G. Identification and quantitation of some characteristic phenolic compounds in elderberry juice by HPLC with coulometric electrode array detection [J]. Current Bioactive Compounds, 2016, 12(4):251-257.

20 LARCHER R, NICOLINI G, BERTOLDI D, et al.Determination of 4-ethylcatechol in wine by high-performance liquid chromatography-coulometric electrochemical array detection [J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 609(2):235-240.

21 LARCHER R, NICOLINI G, PUECHER C, et al. Determination of volatile phenols in wine using high-performance liquid chromatography with a coulometric array detector [J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 582(1):55-60.

22 ACHILLI G, ZHANG Q, ACWORTH I.Evaluation of herb and fruit juice adulteration and authenticity by coulometric array detection and pattern recognition analysis[J].Planta Medica, 2013, 79(13) :1225-1226.

23 ZHANG Q， JENESSE M.The use of gradient HPLC with coulometric electrochemical array detection and pattern recognition to study botanical authenticity[J]. Planta Medica, 2013,79(10):884.

24 錢沖, 廖永紅, 劉明艷. 不同香型白酒的聚類分析和主成分分析[J].中國食品學報, 2017,17(2):243-255. QIAN Chong, LIAO Yonghong, LIU Mingyan. Cluster analysis and principal components analysis of different flavor types of liquor[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017,17(2):243-255.(in Chinese)

25 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.白酒分析方法：GB/T 10345—2007[S]. 北京：中國標準出版社，2007.

26 先春, 陳仁遠, 王俊. 近紅外光譜結合聚類分析對不同風格醬香型白酒的研究[J].釀酒科技, 2016(3):49-51. XIAN Chun, CHEN Renyuan, WANG Jun. Classification of Jiangxiang Baijiu of different styles/different production batches by near infrared spectroscopy coupled with clustering analysis[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2016(3):49-51. (in Chinese)

27 楊綺琴, 方北龍, 童葉翔. 應用電化學[M].2版.廣州：中山大學出版社，2005.

28 張苗苗. 基于光譜的白酒鑒別研究[D].重慶: 重慶大學, 2010. ZHANG Miaomiao. Identification of liquor based on spectral[D]. Chongqing: Chongqing University, 2010. (in Chinese)

29 吳廣黔. 白酒品評[M].1版.北京:中國輕工業出版社，2008.

30 ZHENG J, LIANG R, WU C, et al. Discrimination of different kinds of Luzhou-flavor raw liquors based on their volatile features[J]. Food Research International, 2014, 56(2):77-84.

31 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.固液法白酒:GB/T 20822—2007[S]. 北京：中國標準出版社，2007.