不同來源黑色素瘤BRAF V600E基因突變分析

高正君，謝沛霖，司小強，楊國虎，薛曉東，徐靖宏

(1.甘肅省人民醫院整形美容科 甘肅 蘭州 730000；2.浙江大學附屬第一醫院整形美容科 浙江 杭州 310003)

黑色素瘤（Melanoma，M）是起源于神經嵴的黑素細胞惡性腫瘤，惡性度極高。若早期發現可能通過手術治愈，但進展期和發生遠處轉移者5年生存率不足5%，平均生存期僅2～8個月[1]。美國國立衛生研究院（簡稱NIH）研究表明，黑色素瘤在世界各地的發病率迅速上升。據統計，黑色素瘤中，只有約13%～30%為色素痣來源，其余均為非色素痣來源[2]，而對黑色素瘤相關基因研究發現，BRAF基因是黑色素瘤中突變率最高的基因，是黑色素瘤特異性靶向治療的熱點基因，90%以上是BRAF V600E位點突變[3]，國內目前關于色素痣來源和非色素痣來源的黑色素瘤中BRAF V600E基因突變率的研究尚屬空白。本研究通過對不同來源黑色素瘤中BRAF V600E基因突變進行檢測，以探討BRAF基因突變與不同來源黑色素瘤的臨床表型關系。

1 材料和方法

1.1 材料：選取2010年1月1日-2016年12月31日于本院皮膚科和整形外科收治的84例黑色素瘤患者為研究對象，采集新鮮標本或病灶石蠟組織，所有標本均經病理HE染色和免疫組化診斷證實，見圖1。所有患者均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

圖1 黑色素瘤標本病理檢測結果

1.2 臨床特征

1.2.1 非色素痣來源：共62例標本，男35例，女27例；漢族57例，回族3例，藏族2例；發病年齡26～90歲，平均57.2歲；發病部位：肢端33例，非肢端24例，黏膜5例；淋巴結轉移（-）36例，淋巴結轉移（+）26例，其中遠處轉移6例。

1.2.2 色素痣來源：共22例標本，男12例，女10例；漢族21例，回族1例，藏族0例；發病年齡29～88歲，平均57.5歲；先天性小痣9例，后天痣13例；發病部位：肢端12例，非肢端7例，黏膜3例；淋巴結轉移（-）13例，淋巴結轉移（+）9例，其中遠處轉移1例。

1.3 BRAF V600基因突變檢測方法

1.3.1 腫瘤基因組DNA提取方法：新鮮樣本使用Qiagen公司QIAamP DNA Mini試劑盒提取DNA，石蠟組織使用Qiagen公司的QIAamP DNA FFPE Tissue試劑盒提取DNA，提取后置于-20℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增目標片段：特異引物PCR擴增BRAF V600E基因外顯子15，引物參照相關文獻[3]報道。引物序列：15F：5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’，15R:5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’擴增后目標片段長度362bP。PCR反應體系：總體積為40μl，其中BRAF PCR反應液37μl，BRF酶系3μl。往上述PCR反應管中分別加入提取后的待測樣本核酸、BRAF陰性質控品、BRAF野生型陽性質控品、BRAF突變型陽性質控品10μl，按下列條件擴增：50℃ 2min，95℃ 15min預變性，然后按（94℃30s→55℃ 30s→72℃ 45s）×40個循環擴增，最后72℃延伸7min。

1.3.3 PCR產物檢測并純化：為證實PCR產物中有無目標DNA片段，取5μl PCR產物做1%～2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有目的條帶擴增（目的條帶大小為362bP），如觀察到明顯的單一目的條帶，則將上述PCR產物及時進行純化，具體操作詳見PCR產物純化試劑盒說明書。

1.3.4 基因分析儀測序分析：變性后的測序產物按加樣順序編輯樣品列表。使用ABI基因分析儀，應用ABI公司Data Collection與Sequencing Analysis軟件進行數據收集和分析。運行SeqScanner程序，導入測序結果。找出序列“TAGGTGATTT”。突變分析：序列“TAGGTGATTT”后的第14～16位堿基為600位點，觀察突變位點為單峰或雙峰。

1.4 統計學分析：所有數據應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，四格表資料行χ2檢驗，或行×列表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRAF V600E基因突變檢測結果：V600E未發生突變時，序列為GTG野生型，突變位點為單峰（見圖2A）；發生V600E突變時，為GWG，W表示T/A堿基雜合，突變位點

圖2 BRAF基因突變檢測結果

2.2 BRAF V600E基因突變與臨床表型的關系：由表1可知，非色素痣來源黑色素瘤突變率為45.2%；先天性小痣來源黑色素瘤突變率為11.1%；后天痣來源黑色素瘤突變率為15.4%，組間比較差異有統計學意義（χ2=6.972，P＜0.05）。非色素痣來源黑色素瘤男性、女性突變率分別為28.6%、18.5%，色素痣來源黑色素瘤男性、女性突變率分別為41.7%、30.0%，組間比較差異無統計學意義（χ2=2.358，P＞0.05）。非色素痣來源不同發病部位，肢端、非肢端及黏膜部位，突變率分別為27.3%、29.2%、40.0%，色素痣來源突變率分別為33.3%、28.6%、33.3%，組間比較差異無統計學意義（χ2=0.449，P＞0.05）。

表1 BRAF V600E基因突變率與臨床表型關系 （例）

3 討論

BRAF基因是位于染色體7q34的一種原癌基因。編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，在絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）途徑中起著關鍵作用，通過參與活化細胞表面黑素皮質激素受體，從而參與黑素細胞的增殖分化過程。許多惡性腫瘤中均存在不同比例的BRAF基因突變，黑色素瘤中已知的V600突變有V600E，V600K，V600R,其中V600E位點突變較多[3]。據報道，BRAF基因突變在30%～60%的黑色素瘤中及50%的交界痣中可被觀察到[4]，與國外報道相比，我國黑色素瘤BRAF基因突變率偏低，約為24.3%[5]。中國黑色素瘤的發病和遺傳學特點跟歐美完全不同，歐美黑色素瘤多發生于面部和體表皮膚，誘因主要是陽光暴曬，紫外線接觸過多[6-7]，而亞洲的黑色素瘤多發生于不接觸陽光的部位，發病與基因突變關系更加密切[5]。

BRAF基因突變導致惡性黑色素瘤發生機制尚不清楚，研究發現，突變BRAF基因產物的過表達可增加下游ERK（細胞外調節蛋白激酶，Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）的活性，減少T細胞識別的黑素瘤抗原（Melan-A/MART-1）、糖蛋白100（gp100）等的表達，造成免疫治療障礙。另有文獻報道[8-10]，MAPK通路聯同STAT3(信號傳導與轉錄激活因子通路,Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)可以使黑色素瘤細胞產生多種免疫抑制因子，從而導致免疫逃逸。

在黑色素瘤藥物治療方面，大劑量α-2b干擾素作為黑色素瘤輔助治療用藥已經近半個世紀[11]，分子靶向治療近年來發展迅速，BRAF抑制劑（如vemurafenib維羅非尼、dabrafenib達拉非尼）首先取得突破，隨后BRAF抑制劑聯合MEK(絲裂原活化的細胞外信號調節激酶,Mitogen-activated Extracellular Signal-regulated Kinase,MEK) 抑制劑、PD-1單抗（程序性細胞死亡蛋白-1，Programmed Death-1，PD-1）使得有效率再次提高[12-14]。最近，除BRAF抑制劑外，免疫靶向治療[15-16]、溶瘤病毒瘤體內注射等[17]，也成為治療黑色素瘤的新方向。

色素痣在黑色素瘤的發生中占有重要地位，色素痣惡變為黑色素瘤的百分比各家報道差異甚大，可能與病史回顧不清或如何正確判斷是否源于色素痣有關。有資料顯示，先天性巨痣的惡變率約6%，由于先天性巨痣發生率低，在黑色素瘤中所占比例不大，本研究也無此類病例。

有文章報道BRAF基因突變率與發病部位有相關性，本次研究中將色素痣來源或非色素痣來源的黑色素瘤根據不同來源及發病部位分成了6組，BRAF基因突變率為27.3%～40.0%，但經統計學處理后，差異無統計學意義。而非色素痣來源、先天性小痣來源、后天痣來源的黑色素瘤中BRAF基因突變率分別為45.2%、11.1%、15.4%，組間比較差異有統計學意義，且非色素痣來源黑色素瘤BRAF基因突變率近50%，說明BRAF基因突變在非色素痣來源黑色素瘤中多見，應引起重視。但本次研究中樣本量較少，仍需進一步充實樣本量，以明確不同來源黑色素瘤BRAF基因突變率是否存在差異。

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