苦蕎對高脂膳食誘導小鼠血脂代謝及組織氧化還原的影響

周小理，王 越，趙 燊，周一鳴*，王 宏，侍榮華，肖 瀛

蕎麥為蕎麥屬，我國蕎麥主要分為甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎（F. tataricum L. Gaertn.）2 個栽培品種。蕎麥具有較高的營養價值和藥用價值，被現代營養學家譽為21世紀有最前途的最風行的綠色食品，國外將之視為“高級營養保健品”[1]。隨著人類的飲食結構逐漸向純天然型和保健型發展，有著“藥食兼用”美譽的蕎麥及其系列食品，越來越受到人們的青睞，大力開發和研制蕎麥保健食品有著廣闊的市場前景、較高的經濟價值和社會價值，其相關系列產品在國際和國內的市場上需求很大。

苦蕎作為我國特有的蕎麥品種，其營養成分比甜蕎高出很多，特別是生物類黃酮的含量是甜蕎的13.5 倍，且存在于苦蕎的各個部位[2]。研究表明苦蕎黃酮具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗菌抗病毒以及免疫調節等作用，其具有高抗氧化能力，比化學合成的抗氧化劑如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丁基羥基茴香醚等更安全[3]。同時，苦蕎蛋白（buckwheat protein，BWP）也是苦蕎主要的生物活性成分，約占苦蕎籽粒的15%～17%，主要組成為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白和谷蛋白含量較低，而清蛋白和球蛋白含量較高[4-6]。在功能研究上，苦蕎蛋白提取物具有降低總膽固醇（total cholesterol，TC）濃度，抑制體內脂肪積累，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC），促進排泄等功效[7-8]，具有比大豆蛋白更好的調節血脂效果[9-10]。苦蕎淀粉（buckwheat starch ぼour，BSF）作為苦蕎中最主要的營養成分，含量在60%～70%，尤其是其中的抗性淀粉，具有降低血液TC和甘油三酯（triglycerides，TG）濃度[11-14]的功效，從而可有效降低血脂、預防脂肪肝的形成[15-17]。此外，苦蕎中還含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質等多種營養素，其營養成分種類和含量都是其他谷物所無法比擬的[18-20]。

目前對于苦蕎營養成分的研究主要集中在對其營養成分的提取、鑒定[21-24]以及對其抗氧化[25-27]、降血糖[28-29]等功能的研究，而對于苦蕎中主要營養成分調節血脂代謝及組織氧化還原能力方面的研究卻鮮有報道。本研究通過建立動物（C57BL/6小鼠）高脂模型，分析小鼠血漿的TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹血糖（fasting blood-glucose，GLU）、胰島素（insulin，INS）濃度等血脂指標以及肝臟勻漿液的抗氧化能力，包括SOD活性、T-AOC水平、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、CAT活性，研究苦蕎主要營養成分（蛋白質、淀粉、黃酮類化合物）攝入后對血脂代謝及組織氧化還原性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡雄性實驗用C57BL/6小鼠，SPF級，體質量14～16 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0005（上海，中國）。

苦蕎籽粒（黑豐一號） 山西省左云縣；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇等（均為分析純） 國藥集團（上海）化學試劑有限公司；黃酮（標準品） 上海寶曼生物科技有限公司；TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、小鼠胰島素測定試劑盒、T-AOC測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒等 南京建成生物工程研究所；小鼠飼料為自制。

1.2 儀器與設備

2800型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；血糖測定儀 強生醫療器材有限公司；冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；冷凍離心機美國Sigma公司；Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KK26E28TI超低溫電冰箱 德國西門子有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 上海森地科學儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎主要營養成分的制備

苦蕎中主要營養成分的制備流程見圖1，獲得苦蕎黃酮（ぼavone，Fla）提取物、苦蕎蛋白、苦蕎淀粉。

圖1 苦蕎中主要營養成分的制備流程Fig. 1 Flowchart of preparation of major nutritional components of tartary buckwheat

1.3.2 分組及飼養

45 只4 周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠，以AIN-93G標準飼料預飼1 周，按體質量隨機分為5 組，每組9 只：空白對照組（CK，喂食AIN-93G標準飼料）；高脂組（HF，喂食含有10%（質量分數，下同）脂肪、1%膽固醇和0.5%膽酸鈉的飼料）；苦蕎淀粉高脂干預組（HF＋BSF，即在高脂組飼料的基礎上用苦蕎淀粉替代α-玉米淀粉，且淀粉質量分數為40%）；苦蕎蛋白高脂干預組（HF＋BWP，即在高脂組飼料的基礎上用苦蕎蛋白替代酪蛋白，且蛋白質量分數均為20%）；苦蕎黃酮高脂干預組（HF＋Fla，即在高脂組飼料的基礎上添加質量分數0.5%的苦蕎黃酮）。將小鼠同室且分籠飼養，進行自然光照，并自由飲食和飲水，將環境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為60%。

1.3.3 標本采集及處理

飼養6 周后稱質量，用乙醚將小鼠麻醉后眼球取血，血液立即放入預先用肝素鈉處理的離心管內，4 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清血漿，并保存在-80 ℃的冰箱中待測。隨后立即解剖，迅速取出小鼠的肝臟并稱質量，同時稱取小鼠肝臟約200 mg，加入預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），并在冰浴條件下制備成10%的組織勻漿液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，并保存在-80 ℃的冰箱中待測。

1.3.4 小鼠生長指標的測定

分別按照式（1）、（2）、（3）計算體質量增長率、肝臟系數和腹脂率。

1.3.5 小鼠口服葡萄糖耐受測定

采用血糖測定儀測定禁食12 h（空腹）時GLU濃度/（mmol/L）及灌胃（20%D-葡萄糖溶液的灌胃劑量為2 g/kg體質量）0、30、60、120 min時的血糖濃度B/（mmol/L），并以時間為橫坐標，各時點血糖值為縱坐標，繪制血糖應答曲線，分別按照公式（4）、（5）計算各組灌胃120 min內血糖曲線下面積（area under curve，AUC）[30]及血糖生成指數（glycemic index，GI）[31]。

1.3.6 小鼠血脂生化指標的測定

采用試劑盒法測定血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C、GLU和INS的濃度，具體操作方法根據試劑盒的說明書進行。分別按照公式（6）、（7）計算胰島素敏感指數（insulin sensitivity index，ISI）、動脈粥樣硬化指數（arteriosclerosis index，AI）。

1.3.7 氧化應激指標的測定

脂質過氧化反應產物MDA含量、T-AOC水平、CAT和SOD活力的測定嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 苦蕎主要營養成分對小鼠體質量增長率及臟器指數的影響

表1 苦蕎主要營養成分對小鼠肝臟指數及腹脂率的影響（n＝ 9）Table 1 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on liver index and abdominal fat percentage in mice (n= 9)

由表1可知，HF組的小鼠體質量增長率最大，達到了11.53%，HF＋Fla組和HF＋BWP組次之，HF＋BSF組體質量增長率最小（7.18%），且均低于空白對照組，表明苦蕎中淀粉、蛋白質和黃酮類化合物均能較好抑制肥胖。同時，HF組的肝臟指數達到5.90%，顯著高于HF＋BWP組和HF＋BSF組（P＜0.05），表明高脂膳食能使肝臟質量增加，而苦蕎淀粉和蛋白質能夠顯著降低高脂膳食所引發的肝臟腫大。并且，高脂膳食誘導后小鼠腹脂率較空白對照組有所提高，而HF＋BSF組和HF＋BWP組腹脂率均有顯著降低（P＜0.05），且均能完全恢復至空白對照組的水平。

2.2 苦蕎主要營養成分對小鼠血脂生化指標的影響

由表2可知，HF組血漿中的TC、TG濃度最高，且均顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明小鼠高脂模型建模成功。同時，HF＋BSF組和HF＋BWP組血漿中的TC、TG濃度較HF組均有顯著降低，并且，高脂膳食誘導后小鼠血漿中HDL-C濃度較空白組顯著降低，LDL-C濃度顯著升高，而喂食含有苦蕎淀粉、苦蕎蛋白的飼料后HDL-C濃度較HF組均有顯著升高（P＜0.05），LDL-C濃度有顯著降低（P＜0.05），并且較好地恢復至空白對照組水平。此外，AI值結果表明，高脂膳食可使其升高，從而使動脈粥樣硬化發病率提高，而喂食了含有HF＋BSF的飼料后，AI值能基本恢復至空白組的水平，表明苦蕎主要營養成分對小鼠動脈粥樣硬化具有一定的修復作用。

表2 苦蕎主要營養成分對小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on blood lipid levels in mice

2.3 苦蕎主要營養成分對小鼠血糖指標的影響

表3 苦蕎主要營養成分對小鼠血糖濃度的影響Table 3 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on blood glucose index in mice

由表3可知，各實驗組均在灌胃30 min后達到血糖濃度峰值，灌胃60 min和120 min血糖有下降趨勢，其中，HF組小鼠灌胃120 min后血糖濃度高于HF＋BWP組、HF＋BSF組和HF＋Fla組，其中，HF＋BSF組與HF組有顯著性差異（P＜0.05）。

由表4可知，HF組小鼠GLU濃度最高，HF＋Fla組和HF＋BWP組次之，HF＋BSF組最低。HF＋BWP組和HF＋BSF組與HF組有顯著差異（P＜0.05）。同時，HF組AUG最大，高于其他實驗組，其中，其中HF＋BWP組和HF＋BSF組較HF組差異顯著（P＜0.05），表明高脂膳食誘導引起小鼠糖耐量受損，而苦蕎中淀粉、蛋白質和黃酮類化合物均能改善高脂膳食引起的糖耐量受損。

此外，由表4還可以看出，HF組較空白對照組，血漿中INS濃度顯著增加（P＜0.05），而ISI值最小，說明HF組單位胰島素的效果最差，分解糖類的程度最低。而HF＋BSF組、HF＋BWP組和HF＋Fla組與HS組相比INS濃度增幅較小，ISI值升高，說明苦蕎中淀粉、蛋白質均能顯著抑制高脂膳食所引起的胰島素含量增加，同時，HF＋BSF組和HF＋BWP組可顯著提高ISI值（P＜0.05），并且基本恢復到空白對照組的水平，而HF＋Fla組ISI值也高于HF組，但差異無統計學意義。

2.4 苦蕎主要營養成分對小鼠肝臟組織勻漿抗氧化指標的影響

表5 苦蕎主要營養成分對小鼠臟器抗氧化指標的影響Table 5 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on antioxidant indexes in mouse liver

由表5可知，高脂膳食可導致肝臟勻漿液中的SOD活力降低，其中HF組降幅顯著（P＜0.05），而HF＋BSF組、HF＋BWP組和HF＋Fla組與HF組相比差異顯著（P＜0.05）。T-AOC水平可以全面反映機體整體的抗氧化水平，高脂膳食誘導可引起小鼠肝臟的T-AOC下降，而各實驗組的T-AOC均有所上升，其中HF＋BSF組最高；MDA是機體內環境脂質過氧化反應的終極代謝產物，該值的大小可以代表機體的脂質過氧化水平，在一定條件下間接揭示了細胞被破壞程度。高脂膳食誘導可引起小鼠肝臟的MDA含量顯著上升（P＜0.05），而各實驗組均可顯著抑制高脂飲食引起的脂質過氧化（P＜0.05）；CAT活力反映的是整個機體的氧化應激水平，高脂膳食可顯著降低CAT的活力（P＜0.05），說明其抗氧化能力較弱，而喂養不同的飼料后，CAT活力顯著升高（P＜0.05），且HF＋BSF組的效果最佳。綜上所述，苦蕎淀粉、蛋白質和黃酮類化合物均能較好地保護機體抗氧化系統，且均能恢復至空白對照組的水平。

2.5 生理生化指標與肝臟抗氧化性的相關性分析

表6 生理生化指標與肝臟抗氧化性的相關性分析（n＝9）Table 6 Correlation analysis between physio-biochemical indexes and antioxidant activity in liver (n= 9)

從表6可以看出，T-AOC、CAT活力、SOD活力與HDL-C濃度、ISI值呈正相關，與其他指標均呈負相關，其中T-AOC和SOD活力與AI值呈顯著負相關（P＜0.05），說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低；MDA含量與HDL-C濃度、ISI值呈負相關，相關程度較高，與其余指標均呈正相關，且與LDL-C濃度呈顯著正相關（P＜0.05），說明LDL-C濃度越高，肝臟的脂質過氧化產物MDA含量越高，其中MDA與AI值呈顯著正相關（P＜0.05），說明AI值越高，肝臟的抗氧化能力越低，脂質過氧化越嚴重。

3 討 論

隨著生活水平的提高，現代社會人們的飲食結構從低脂高膳食纖維飲食向高脂高糖飲食轉變，而高脂高糖飲食是血液生化指標發生紊亂的誘因。血液生化指標紊亂會引起心腦血管疾病，影響人類的身體健康，如2型糖尿病的重要特征就是血脂血糖水平不正常。本研究在建立小鼠高脂模型基礎上，通過對小鼠主要生長指標、血液生理生化指標以及肝臟組織氧化應激指標的測定，研究了苦蕎主要營養成分（蛋白質、淀粉、黃酮類化合物）攝入后對血脂代謝及組織氧化還原性的影響。實驗結果表明：高脂膳食能夠引起體質量增加和GLU濃度的顯著升高，降低胰島素效果，從而在誘發小鼠產生肥胖的同時，有并發糖尿病的趨勢；而在高脂膳食中添加苦蕎淀粉、蛋白質和黃酮類化合物可降低高脂膳食所帶來的體質量增加，而且可以有效降低小鼠GLU濃度，改善高脂飲食引起的糖耐量受損，提高ISI值。同時，高脂飲食顯著升高小鼠血漿中TC、TG、LDL-C濃度和AI值，并且使HDL-C濃度降低，而苦蕎（淀粉、蛋白質和黃酮類化合物）可顯著降低高脂膳食引起的血漿中TC、TG濃度以及LDL-C濃度的上升，同時有效降低高脂膳食所引起的AI值升高，降低動脈粥樣硬化發病率。此外，苦蕎（淀粉、蛋白質和黃酮類化合物）對機體內抗氧化系統具有較好的保護和修復與作用，可以提高組織中T-AOC水平、顯著提高CAT和SOD活力，抑制MDA的產生。最后，生理生化指標與肝臟抗氧化性的相關性分析表明：T-AOC、CAT和SOD活力與HDL-C濃度、ISI值呈正相關，與其他指標均呈負相關，其中T-AOC和SOD活力、AI值呈顯著負相關，說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低；MDA含量與HDL-C濃度、ISI值呈負相關，與其他指標均呈正相關，其中MDA含量與AI值呈顯著正相關，說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低，脂質過氧化越嚴重。

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