消化對益生菌干酪抗氧化活性的影響

曲秀偉，劉 璐，王海霞，李曉東*，張秀秀，陳 萍，沈 琪

契達干酪（Cheddar cheese）是一種酸性半硬質成熟干酪[1]，是世界干酪生產的主要品種之一，也是世界上購買與消費最多的一種干酪。契達干酪在成熟過程中伴隨著一系列復雜的生化反應，如糖酵解、脂肪和蛋白質水解等[2]。其中，蛋白質水解是干酪成熟中最重要和復雜的反應之一，不僅對干酪的質地和風味產生重要影響[3-4]，而且在此過程中，酪蛋白被來自發酵劑微生物菌群所分泌的蛋白酶和肽酶水解成各種生物活性肽[5]，所以干酪具有較高的營養價值。

近年來，關于功能型益生菌乳制品的開發受到各國學者的關注。益生菌能夠調節腸道菌群、合成維生素和促進營養物質吸收，同時具有提高機體免疫、降膽固醇、抗氧化等生理功能[6-7]。研究表明，干酪的稠密基質和相對較高的脂肪含量可以對高酸性環境中的益生菌起到緩沖和保護作用，是傳遞益生菌的良好載體[8]。有研究表明，將益生菌應用到干酪等乳制品中，既對產品的抗氧化活性產生影響，又能夠產生具有抗氧化活性的多肽[1,9]。Mushtaq等[10]研究表明益生菌的添加能提高貯藏期卡拉里干酪的抗氧化活性，且不同益生菌對干酪抗氧化活性的提高程度不同。有學者從添加干酪乳桿菌的契達干酪中提取了5 種分子質量低于3 kDa的短肽，其中氨基酸序列為VKEAMAPK的短肽與天然抗氧化劑丁基羥基茴香醚、特丁基對苯二酚的抗氧化活性接近[11]。然而，食品中的活性成分只有順利經過胃腸消化并被機體吸收利用，才能發揮其生物活性；因此，一個必要的前提是在體外建立胃腸道消化模型對其進行體外驗證。目前，關于益生菌干酪的抗氧化活性在胃腸消化時的變化研究較少，主要集中在活菌數的變化，研究表明干酪中的益生菌經消化后有良好的存活，能夠維持在106CFU/g左右[12]。有學者對干酪模擬胃腸道消化后血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性的變化進行研究，結果顯示模擬胃腸道消化后干酪ACE抑制活性有所增加，可能是由于大分子質量的蛋白水解產生一些具有ACE抑制活性的短肽[13]。

因此，本實驗研究益生菌契達干酪經模擬胃腸道消化后抗氧化活性的變化，探究模擬胃腸道消化對干酪抗氧化活性的影響并明確影響因素，以期為評價干酪成熟過程中形成的抗氧化肽及存活的菌種對人體的抗氧化作用提供理論參考，為益生菌在干酪中的應用開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）07-300B、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）1.0357來自東北農業大學乳品重點實驗室的菌種庫；商業發酵劑（L. lactis subsp. cremoris和L. lactis subsp. lactis混合菌種）、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司。

生牛乳（新鮮無抗乳）取自哈爾濱市香坊農場完達山奶源基地；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid，ABTS） 美國Sigma公司；氯化鐵、鐵氰化鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 上海凌峰化學試劑有限公司；胰蛋白酶（250 U/L）、胃蛋白酶（3 000 U/L）諾維信（中國）生物技術有限公司；谷胱甘肽（還原型） 美國Amresco公司。其他試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子分析天平、pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司；數顯恒溫水浴箱 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；FUT-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

以空白、單一及復合添加雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的契達干酪為研究對象，以DPPH自由基清除率、還原力及ABTS＋·清除率為評價指標，研究干酪在模擬胃腸道消化后抗氧化活性的變化；同時研究模擬胃腸道消化后益生菌活菌數、多肽含量的變化以及不同分子質量多肽的抗氧化活性，探究益生菌活菌數及多肽的變化對干酪抗氧化活性的影響，明確干酪在模擬胃腸道消化過程中抗氧化活性變化的影響因素。

1.3.2 雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌輔助發酵劑的制備

雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌輔助發酵劑的制備參照Chaves等[12]的方法略作改動。雙歧桿菌07-300B、嗜酸乳桿菌1.0357分別以體積分數2%接種到60 mL質量分數12%滅菌復原脫脂乳中，厭氧培養24 h，培養兩代至活菌數為1.0×109CFU/mL左右備用，以體積分數1.2%添加于干酪中。

1.3.3 益生菌契達干酪的制作

益生菌契達干酪的制作及分組如下：空白組：只添加質量分數0.01%商業發酵劑；實驗組：1）雙歧桿菌組：添加質量分數0.01%商業發酵劑和體積分數1.2%雙歧桿菌；2）嗜酸乳桿菌組：添加質量分數0.01%商業發酵劑和體積分數1.2%嗜酸乳桿菌；3）雙歧桿菌＋嗜酸乳桿菌組：添加質量分數0.01%商業發酵劑、體積分數0.6%雙歧桿菌和體積分數0.6%嗜酸乳桿菌。干酪的制作參照Ayala-Bribiesca等[14]的方法。

1.3.4 干酪模擬胃腸道實驗

模擬胃液、腸液的制備參照Mozzi等[15]的方法略作改動。人工胃液的組成包括氯化鉀（1.12 g/L）、氯化鈉（2.0 g/L）、氯化鈣（0.11 g/L）和磷酸二氫鉀（0.4 g/L），需經過121 ℃殺菌15 min。用之前，添加胃蛋白酶（0.2 g/L），用1 mol/L HCl溶液調pH值到2.0。模擬腸液則將胰蛋白酶添加到配制好的胃液中，達到最終濃度為1.95 g/L，用1 mol/L NaHCO3溶液調pH值到7.0。

將成熟24 周后的各組干酪研碎，取10 g干酪放入裝有100 mL模擬胃液的錐形瓶中，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中模擬胃液消化2 h；胃液消化后，向消化液中加入0.195 g胰蛋白酶，并用1 mol/L的NaHCO3溶液調整pH值為7.0，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中模擬腸液消化4 h[13]。

1.3.5 胃液、腸液消化后及消化前樣品的制備

將各組干酪經胃液、腸液消化后的樣液，在4 ℃、3 000×g離心30 min，取上層溶液通過Whatman No. 2濾紙過濾，所得提取液即為胃液、腸液消化后樣品。消化前的樣品制備參照Bottesini等[16]的方法略作修改，將10 g干酪加入到100 mL蒸餾水中，混合勻漿1.5 min，然后在4 ℃，3 000×g下離心30 min，取上層溶液通過Whatman No. 2濾紙過濾，所得水溶性提取液即為消化前樣品[16]。

1.3.6 干酪經模擬胃腸道消化抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除率的測定參照Shen Yingbin等[17]的方法；還原能力的測定參照Duh等[18]的方法，以A700nm表示；ABTS＋·清除率的測定參照Abadía-García等[9]的方法。

1.3.7 干酪經模擬胃腸道消化益生菌活菌數測定

益生菌的計數參照de Oliveira等[19]的方法，采用MRS稀釋平板法計數。

1.3.8 干酪經模擬胃腸道消化多肽變化研究

1.3.8.1 干酪SDS-PAGE

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）參照金江玉等[20]的方法，選用低分子質量蛋白Marker（1.06～26.60 kDa）。

1.3.8.2 干酪經模擬胃腸道消化多肽質量濃度變化測定

標準曲線的繪制：配制10.0 mg/mL的谷胱甘肽標準溶液，依次吸取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL置于6 支試管中，分別加入4 mL雙縮脲試劑，用蒸餾水定容至10 mL，于60 ℃水浴下顯色5 min，水浴期間不停地振蕩，然后冷卻至室溫，于540 nm波長處測定吸光度（以第1管作空白對照）。以多肽質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

多肽含量的測定參照徐娟等[21]的方法略作修改。取5.0 mL樣品溶液，加入5.0 mL 10 g/100 mL的TCA水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置20 min，然后4 000×g離心10 min。然后取2.0 mL上述溶液置一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，60 ℃水浴顯色5 min，2 000×g離心10 min。取上清液于540 nm波長處測定吸光度，對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽質量濃度（mg/mL）。

1.3.8.3 超濾分離干酪多肽及抗氧化活性測定

選用截留分子質量（10、3 kDa）的超濾膜對干酪多肽進行分離，先后得到不同截留分子質量的超濾液，得到3 個不同的組分：組分Ⅰ：（＞10 kDa）、組分Ⅱ：（3～10 kDa）、組分Ⅲ：（＜3 kDa）收集備用。不同分子質量多肽DPPH自由基清除率、還原能力、ABTS＋·清除率的測定方法同1.3.6節所述。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 干酪經模擬胃腸道消化抗氧化活性的變化2.1.1 DPPH自由基清除率變化

DPPH自由基能夠穩定存在，且易與具有氫鍵供體的化合物發生電子轉移反應，已成為檢測物質抗氧化活性的一種常用方法[22]。本實驗測定了干酪消化后DPPH自由基清除率的變化，結果如圖1所示。

圖1 干酪經模擬胃腸道消化DPPH自由基清除率變化Fig. 1 Change in DPPH radical scavenging activity of cheese after simulated gastrointestinal digestion

由圖1可知，空白組及各實驗組益生菌干酪DPPH自由基清除率經模擬胃腸道消化后均有顯著提高（P＜0.05）。空白組干酪DPPH自由基清除率從（34.79±3.11）%增加到（54.69±2.89）%，增幅為57.20%；復合添加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的干酪DPPH自由基清除率從（48.28±1.42）%增加到（82.76±3.19）%，增幅達到71.42%，益生菌干酪經胃腸道消化后DPPH自由基清除率的變化更加顯著，表明益生菌干酪經胃腸道消化后產生了更多具有抗氧化活性的物質，為DPPH自由基提供了氫，使其形成穩定的分子[23]。研究表明，酪蛋白經胰蛋白酶水解后DPPH自由基清除率有所升高，由15%提高到50%[24]，同時多肽的濃度和分子質量均顯著影響自由基清除率，多肽分子質量越小，對生物體內自由基清除效果越好，清除率越高[25]。因此本研究中益生菌干酪經胃腸道消化后DPPH自由基清除率的增加，有可能是由于干酪中的酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶以及益生菌產生的蛋白酶作用下，降解生成了一些具有抗氧化活性的多肽。

2.1.2 還原力變化

還原能力是表征物質在氧化還原反應中給出電子，自身發生氧化的能力，是物質具有抗氧化活性的重要表現[26]。

圖2 干酪經模擬胃腸道消化還原力變化Fig. 2 Change in reducing power of cheese after simulated gastrointestinal digestion

由圖2可知，消化前空白組、各實驗組益生菌干酪的還原力分別為0.394±0.035、0.496±0.032、0.497±0.009、0.510±0.007，經過6 h的模擬胃腸道消化后各組干酪的還原力顯著提高（P＜0.05），分別增加到0.593±0.042、0.823±0.025、0.826±0.019、0.828±0.021，增幅分別為50.51%、65.93%、66.20%、62.35%。還原力的顯著提高可能是由于益生菌干酪經模擬胃腸道消化后產生更多的物質提供氫原子，將Fe3＋還原成Fe2＋，從而打斷自由基連鎖反應[27]。有研究表明酸乳中分子質量大于30 kDa和在10～30 kDa之間的多肽的還原能力分別為0.028和0.055，明顯低于抗壞血酸的0.429；相反，分子質量低于3 kDa的多肽的還原能力達到0.917，要顯著高于抗壞血酸，表明不同分子質量的多肽還原力不同，即抗氧化活性也就不同[28]。本研究的4 組干酪中，復合添加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的干酪還原力在各個時期均為最高，但與除空白組外的其他組別無明顯差異（P＞0.05），此結果表明，單一或復合添加益生菌對干酪還原力的變化影響較小。

2.1.3 ABTS＋·清除率變化

ABTS＋·也是一種穩定的自由基，根據樣品對ABTS＋·溶液吸光度的影響測定其對ABTS＋·的清除能力，從而評價樣品的抗氧化活性[22]，干酪消化后ABTS＋·清除率的變化如圖3所示。

圖3 干酪經模擬胃腸道消化ABTS＋ ·清除率變化Fig. 3 Change in ABTS+· scavenging activity of cheese after simulated gastrointestinal digestion

由圖3可知，空白組及各實驗組益生菌干酪經模擬胃腸道消化后ABTS＋·清除率均顯著提高（P＜0.05），各益生菌干酪ABTS＋·清除率均顯著高于空白組（P＜0.05）。復合添加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的干酪ABTS＋·清除率為最高（P＜0.05），從消化前的（29.56±1.43）%增加到模擬胃腸道消化后的（44.84±1.36）%，增幅達到51.69%。Corrêa等[27]研究表明羊乳酪乳清經6 h蛋白酶水解后，ABTS＋·清除率同樣有所提升，從15.98%上升到55.30%。本研究中各實驗組益生菌干酪在各階段的ABTS＋·清除率均有顯著性差異，表明不同的益生菌對干酪ABTS＋·清除率有顯著不同影響，這與Mushtaq等[10]研究結果相一致。此外，研究已證實一些氨基酸如組氨酸（由于其咪唑環分解后可作為氫受體，捕捉自由基）、酪氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸都具有較強的自由基清除能力[29]。因此本研究中干酪模擬胃腸道消化后ABTS＋·清除率的升高，也可能與產生了這類氨基酸有關。

2.2 干酪經模擬胃腸道消化益生菌活菌數變化

圖4顯示了干酪經模擬胃腸道消化后益生菌活菌數的變化。消化前空白組、各實驗組益生菌干酪中益生菌活菌數分別為（4.67±0.13）、（7.52±0.26）、（7.48±0.29）、（7.62±0.03）lg（CFU/g），模擬胃腸道消化后活菌數有所降低，分別為（3.68±0.11）、（6.37±0.12）、（6.19±0.36）、（6.33±0.14）lg（CFU/g），分別降低了21.20%、15.29%、17.25%、16.93%。本研究結果表明干酪中的益生菌經模擬胃腸道消化后有良好的存活，原因可能是益生菌受到干酪蛋白質-脂肪基質的保護作用[19]。本研究結果顯示益生菌活菌數經模擬胃腸道消化后顯著減少，而2.1節中的研究表明模擬胃腸道消化后抗氧化活性顯著升高，可以說明在模擬胃腸道環境下益生菌菌體本身的功能特性對干酪抗氧化活性的增加作用較小，抗氧化活性變化的原因仍需進一步研究。

圖4 干酪經模擬胃腸道消化益生菌活菌數變化Fig. 4 Change in viable counts of probiotic bacteria in cheese after simulated gastrointestinal digestion

2.3 干酪經模擬胃腸道消化多肽的變化

2.3.1 干酪SDS-PAGE結果

SDS-PAGE具有分子篩效應，根據蛋白分子質量亞基的不同，能夠有效分離乳中的主要蛋白質，達到定性和定量的目的[20]。

圖5 干酪模擬胃腸道消化前后的SDS-PAGEFig. 5 SDS-PAGE of cheese proteins before and after simulated gastrointestinal digestion

圖5為干酪模擬胃腸道消化前后的電泳結果，模擬胃腸道消化前各組均有兩條分子質量較大的條帶，有學者指出，這兩條大的條帶可能是αs1-酪蛋白和β-酪蛋白，它們的分子質量和條帶相接近，分別為23.6 kDa和24.0 kDa，這兩種酪蛋白分別占牛乳酪蛋白的36%和30%[13]。Sánchez-Rivera等[30]研究表明，干酪消化后小肽的數量有所增加，且主要由αs1-酪蛋白和β-酪蛋白產生。本研究中模擬胃腸道消化后，兩條大的條帶仍存在，但是染色情況變弱，在分子質量為1.06～14.2 kDa區間出現了3 條清晰的條帶，分子質量分別為2、4、10 kDa左右，表明干酪經模擬胃腸道消化后產生更多小分子質量多肽。

2.3.2 干酪經模擬胃腸道消化多肽含量變化

以谷胱甘肽為標準物質，在540 nm波長處建立谷胱甘肽質量濃度與吸光度之間的關系，回歸方程為y＝0.054 8x-0.008 1（R2＝0.996 2），線性關系良好，可用于計算干酪中多肽含量。干酪消化后多肽含量的變化如圖6所示。

圖6 干酪經模擬胃腸道消化多肽質量濃度變化Fig. 6 Change in polypeptide content in cheese after simulated gastrointestinal digestion

由圖6可知，消化前空白組、各實驗組益生菌干酪提取液中多肽質量濃度分別為（1.62±0.09）、（1.81±0.07）、（1.84±0.01）、（2.01±0.06）mg/mL，模擬胃腸道消化后多肽質量濃度顯著升高（P＜0.0 5），分別達到（2.0 1±0.0 6）、（2.50±0.10）、（2.55±0.07）、（2.80±0.02）mg/mL，增幅分別為24.07%、38.12%、38.59%、39.30%，表明干酪在模擬胃腸道消化過程中，胃蛋白酶和胰蛋白酶對干酪蛋白質降解作用顯著，產生更多的生物活性肽。Sánchez-Rivera等[30]研究指出，藍紋干酪中存在ACE抑制肽和阿片肽，經胃腸道消化后會產生更多的肽類，比如抗氧化肽和抗菌肽。本研究的實驗組益生菌干酪中，復合添加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的干酪中多肽含量在各個階段均為最高，且各實驗組益生菌干酪多肽含量都顯著高于空白組干酪（P＜0.05）。乳桿菌已經被證明具有產生二肽酶、羧肽酶、三肽酶、氨肽酶和肽鏈內切酶的能力[31]，因此本研究中雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的蛋白酶可能在蛋白水解中發揮了作用[32]。此外，研究表明，酪蛋白多肽的抗氧化活性不僅與多肽的質量濃度有關，還與多肽分子質量的大小有關[23,25]，因此，有必要研究不同分子質量多肽的抗氧化活性。

2.3.3 所產多肽抗氧化活性的分析

利用超濾膜將模擬胃腸道消化后復合添加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的干酪多肽進行分離，得到3 個不同分子質量的組分，組分Ⅰ（＞10 kDa）、Ⅱ（3～10 kDa）、Ⅲ（＜3 kDa）。由表1可知，不同分子質量的多肽組分其抗氧化指標均存在顯著性差異（P＜0.05）。分子質量小于3 kDa的多肽組分各抗氧化指標均為最高，DPPH自由基清除率、還原力、ABTS＋·清除率分別為（96.47±2.06）%、0.917±0.078、（83.58±4.83）%，顯著高于超濾前樣品的各抗氧化指標（P＜0.05）。本研究結果表明分子質量小于3 kDa的多肽在干酪中是最主要的抗氧化組分，模擬胃腸道消化后干酪抗氧化活性的提高很可能與這類具有高抗氧化活性的小分子質量多肽有關。

表1 不同分子質量多肽抗氧化活性比較Table 1 Comparison of antioxidant properties of polypeptides with different molecular weights

3 結 論

本研究得出，模擬胃腸道消化后益生菌干酪抗氧化活性顯著提高（P＜0.05），其中復合添加雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的干酪抗氧化指標顯著高于其他組（P＜0.05）；消化后干酪中益生菌活菌數降低，而多肽含量顯著增加（P＜0.05），其中分子質量小于3 kDa的多肽抗氧化活性最高，表明干酪在益生菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下產生了更多具有抗氧化活性的小分子多肽，使其抗氧化活性得以提高。而對于益生菌干酪在體內代謝環境下抗氧化活性的變化及機制則有待進一步研究。

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