基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR技術(shù)對(duì)啤酒花進(jìn)行純度檢測(cè)

蔣培基，王德良，江偉，宋濤，李濤，蒲彪，欒春光*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

啤酒花，桑科草屬多年生攀援草本植物，雌雄異株，是除大麥之外啤酒釀造的主要原料之一，被稱(chēng)之為“啤酒之魂”、“綠色黃金”[1]。其主要功能成分是酒花樹(shù)脂、酒花油和多酚物質(zhì)。這些物質(zhì)賦予啤酒以特有的苦味與香味[2]。此外，酒花樹(shù)脂還具有防腐的能力，可以延長(zhǎng)啤酒的保質(zhì)期，而多酚物質(zhì)中的單寧則具有澄清麥汁的作用[3]。

2014年，全球的酒花產(chǎn)量在96 000 t左右[4]，其中國(guó)產(chǎn)啤酒花產(chǎn)量達(dá)到了12 500 t，占到了13%[5]。我國(guó)的啤酒花主要分布在甘肅、新疆兩省，甘肅種植面積最大，且甘肅省河西走廊的暖溫帶干旱氣候有助于優(yōu)良啤酒花的培育。啤酒花的品種以及添加工藝的不同會(huì)使啤酒形成不同的苦味與風(fēng)味特征[6]，例如Chinook和Cascade酒花能夠賦予啤酒樹(shù)脂和柑橘類(lèi)水果風(fēng)味[7]。此外，啤酒花品種對(duì)啤酒的質(zhì)量也會(huì)產(chǎn)生影響，聶聰[8]等人的研究表明，香型酒花的品種是決定啤酒香味質(zhì)量的關(guān)鍵，在釀造過(guò)程中應(yīng)多用苦香兼優(yōu)型、香型和免煮沸酒花制品。

盡管人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到酒花品種對(duì)啤酒質(zhì)量起著重要作用，但一直以來(lái)，酒花的品種鑒定是一個(gè)難題。這主要是因?yàn)槠【苹ㄆ贩N鑒別通常使用傳統(tǒng)方法，即從形態(tài)上加以區(qū)別，包括啤酒花的顏色、形態(tài)及主要成分[9]。但由于市場(chǎng)需求和工藝的改進(jìn)，供應(yīng)商提供的酒花都是經(jīng)過(guò)粉碎后制成的顆粒酒花制品，無(wú)法使用傳統(tǒng)的方法加以鑒別。為此分子水平的鑒定方法，例如種子貯藏蛋白或同工酶電泳等經(jīng)典的物種鑒定方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)。但以上方法無(wú)法滿足物種鑒定所需的效率和精確度[10]。而基于第一、二代DNA分子標(biāo)記技術(shù)建立起來(lái)的鑒定方法，比如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)[11-13]和微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeats,SSRS)[11,14-15]雖然相對(duì)于蛋白水平的鑒定具有一定優(yōu)勢(shì)，但這些方法都是基于核酸片段的多少和片段大小來(lái)完成物種的鑒別，因此對(duì)于親緣關(guān)系相近的兩個(gè)品種存在判斷上的誤差，且無(wú)法完成混雜或人為摻雜的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

作為第3代DNA分子標(biāo)記技術(shù)的SNP(單核苷酸多態(tài)性)的出現(xiàn)為酒花品種的定性和定量鑒定提供了更為可靠的手段。有研究表明，SNP將會(huì)是一種高效、準(zhǔn)確的品種鑒定工具。PITRA[16]對(duì)178個(gè)酒花品種進(jìn)行基因測(cè)序，分析后共獲得了17 128個(gè)SNP位點(diǎn)。HENNING[17]等對(duì)121個(gè)酒花品種進(jìn)行測(cè)序后得到了1 006個(gè)SNP位點(diǎn)，最終確定了7個(gè)可以區(qū)分121個(gè)酒花品種的SNP位點(diǎn)。YAMAUCHI[18]通過(guò)對(duì)酒花品種轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，最終得到能分開(kāi)16個(gè)酒花品種的SNP組合。以上研究雖然在尋找可用于酒花品種鑒定的SNP組合的工作上取得了一些進(jìn)步，但并沒(méi)有建立一套系統(tǒng)的、可靠的酒花品種鑒定方法。而且，以上研究中存在SNP真實(shí)性驗(yàn)證的可靠性低、樣品代表性差以及無(wú)法對(duì)混合樣品定性定量測(cè)試等缺點(diǎn)。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究提出了一種利用最新的SNP分子標(biāo)記技術(shù)與KASP基因分型檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合[19]，對(duì)混合的商業(yè)啤酒花顆粒進(jìn)行純度檢測(cè)的技術(shù)。該技術(shù)可以滿足啤酒企業(yè)對(duì)原料的質(zhì)量監(jiān)測(cè)的要求，同時(shí)可為啤酒企業(yè)對(duì)原料質(zhì)量的把控提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬可波羅、Saaz、Tradition、Magnum、Aurora、Galenq、Centinnia啤酒花樣品由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院收集。預(yù)混樣品是由Tradition啤酒花與Magnum啤酒花按照不同的質(zhì)量百分比進(jìn)行混合，混合比例為0%、2%、5%、10%、20%、40%、50%、100%，并標(biāo)記為T(mén)1～T8。某啤酒廠送檢的2份不同批次的Saaz商業(yè)啤酒花樣品，標(biāo)記為樣品A與樣品B。

Taq酶、dNTP、10×loading buffer購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；KASP引物，上海艾吉析科技有限公司；Qiagen DNeasy Plant Mini Kit(50)植物基因組高效提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)凱杰生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96 Well Thermal Cycler、Qubit 3.0，北京Thermo Fisher Scientific有限公司；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒花基因組的提取

稱(chēng)取啤酒花樣品20 mg，加液氮研磨。研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至2 mL effendorf管中，按QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(50)DNA提取試劑盒步驟提取啤酒花基因組DNA。利用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳和Nanodrop核酸檢測(cè)儀對(duì)提取到的酒花樣品基因組進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 SNP位點(diǎn)的篩選

從DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)上查找并下載啤酒花基因組信息(登錄號(hào)：PRJDB3233)。同時(shí)，結(jié)合本研究測(cè)序的7個(gè)酒花樣品基因組信息(本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，未發(fā)表)完成SNP位點(diǎn)的篩選。然后，使用premier 5.0軟件在SNP位點(diǎn)前后200 bp處設(shè)計(jì)引物，用來(lái)擴(kuò)增對(duì)應(yīng)帶有SNP位點(diǎn)的DNA片段，引物由北京生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：包括10×loading buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL；基因組DNA 1 μL；Taq酶 0.2 μL；ddH2O 17.3 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min ；95 ℃變性30 s, 52～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序由北京生工生物完成，測(cè)序結(jié)果使用MegAlign軟件進(jìn)行比對(duì)。篩選并統(tǒng)計(jì)多態(tài)性良好的SNP位點(diǎn)信息，以及7個(gè)啤酒花品種在位點(diǎn)上的基因型，用來(lái)建立區(qū)分圖。

1.3.3 預(yù)混樣品的檢測(cè)

根據(jù)篩選出來(lái)的SNP位點(diǎn)信息合成KASP引物。同時(shí)，提取T1～T8預(yù)混樣品的基因組DNA作為反應(yīng)模板，使用篩選得到的8個(gè)SNP位點(diǎn)的KASP引物在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀器上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為：DNA 1 μL ,2×master mix 5 μL, 雙蒸水 4 μL, primer mix 0.14 μL。KASP反應(yīng)條件按照使用說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)條件的設(shè)置以及結(jié)果的讀取均在7500 Software v2.3.軟件上進(jìn)行。

1.3.4 實(shí)際樣品的真實(shí)性檢測(cè)

分別稱(chēng)取5 g的樣品A與樣品B，加液氮在研缽中充分研磨，分別將100 mg樣品轉(zhuǎn)移至2mL EP管中。基因組的提取參照1.3.1提取方法進(jìn)行并檢測(cè)。此過(guò)程重復(fù)3次。樣品分別標(biāo)記為A1、A2、A3與B1、B2、B3。根據(jù)路線區(qū)分圖選擇合適的SNP位點(diǎn)。利用相應(yīng)的KASP引物在ABI7500Real-time PCR儀器上進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的條件以及結(jié)果的讀取均參照1.3.3進(jìn)行。

1.3.5 實(shí)際樣品的純度檢測(cè)

本研究采用固定初始質(zhì)量比的方法對(duì)預(yù)混樣進(jìn)行定量分析。根據(jù)真實(shí)性檢測(cè)結(jié)果，選取具有多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果的SNP位點(diǎn)，以該位點(diǎn)2種不同基因的啤酒花標(biāo)品DNA按照100%、95%、90%、80%、60%、40%、0%比例混合作為固定比例標(biāo)準(zhǔn)曲線。以提取的實(shí)際樣品基因組DNA為模板，用具有多態(tài)性的SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的KASP引物在ABI7500 Real-time PCR儀器上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的條件以及結(jié)果的讀取均參照1.3.3進(jìn)行,結(jié)果重復(fù)讀取3次。統(tǒng)計(jì)結(jié)果中2種不同基因型的熒光信號(hào)值，通過(guò)SPSS軟件建立多元回歸方程，計(jì)算樣品純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒花DNA的提取

研究中提取的啤酒花基因組經(jīng)0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測(cè)后，條帶完整，沒(méi)有降解。且條帶大小處于所需目的片段范圍之內(nèi)。經(jīng)Qubit3.0定量檢測(cè)后，DNA質(zhì)量濃度均大于120 ng/μL，完全符合實(shí)驗(yàn)所需的DNA濃度要求。

2.2 SNP位點(diǎn)的篩選

根據(jù)啤酒花基因組信息和生物信息學(xué)分析結(jié)果，共篩選出8個(gè)多態(tài)性較好的SNP位點(diǎn)。SNP位點(diǎn)所在片段的擴(kuò)增使用的普通PCR引物見(jiàn)表1。篩選出來(lái)的多態(tài)性良好的SNP位點(diǎn)信息如表2所示(其中H07與H08位點(diǎn)位于同一擴(kuò)增片段)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)的不同啤酒花品種在SNP位點(diǎn)上的基因型，建立了7個(gè)啤酒花品種的SNP數(shù)據(jù)表(表3)，同時(shí)建立區(qū)分路線圖(圖1)。

表1 本研究使用的普通PCR引物

表2 本研究所用的SNP標(biāo)記

表3 研究驗(yàn)證并使用的啤酒花品種的SNP

2.3 預(yù)混樣品的檢測(cè)

通過(guò)以上8個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)和篩選(結(jié)果見(jiàn)圖2)，8個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果都符合預(yù)混樣在位點(diǎn)的基因型，其中H03、H04、H06位點(diǎn)在T1～T8號(hào)預(yù)混樣品檢測(cè)過(guò)程中表現(xiàn)出良好的分型。從圖2可以看出，2%的預(yù)混樣在H03與H04號(hào)位點(diǎn)都被系統(tǒng)判定為雜合，在H06位點(diǎn)被系統(tǒng)判定為純合。因此，H06位點(diǎn)無(wú)法對(duì)2%以下的混合樣品進(jìn)行正確的判斷。進(jìn)一步的檢測(cè)結(jié)果表明，5%的預(yù)混樣品在3個(gè)SNP位點(diǎn)都被判定為雜合狀態(tài)，說(shuō)明該方法可以滿足對(duì)混雜比例>5%的啤酒花樣品進(jìn)行檢測(cè)的要求。且圖中各比例混雜樣品的檢測(cè)結(jié)果是呈線性比例關(guān)系分布。

圖1 七個(gè)品種基于SNP區(qū)分路線圖Fig.1 Seven species differentiate route map based on SNP

圖2 T1～T8樣品在8個(gè) SNP位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of T1～T8 samples at eight SNP maker

2.4 實(shí)際樣品的真實(shí)性檢測(cè)

根據(jù)酒花品種區(qū)分路線圖可知， H05與H02位點(diǎn)可以用來(lái)對(duì)樣品A與樣品B進(jìn)行區(qū)分鑒定。樣品A的檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果表明，樣品A基因型檢測(cè)結(jié)果與Sazz完全符合，表明樣品A為純度很高的Saaz啤酒花，純度大于95%。樣品B的檢測(cè)結(jié)果如圖5、圖6所示，其中H05的基因型檢測(cè)結(jié)果與Sazz標(biāo)準(zhǔn)品一致，而H02位點(diǎn)出現(xiàn)了雜合狀態(tài)，表明樣品B是含有一定比例的混雜樣品。

圖3 H05位點(diǎn)樣品A基因型檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The qualitative detection result of Sample A at H05

圖4 H02位點(diǎn)樣品A基因型檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The qualitative detection result of Sample A at H02

圖5 H05位點(diǎn)樣品B基因型檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The qualitative detection result of Sample B at H05

圖6 H02位點(diǎn)樣品B基因型檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The qualitative detection result of Sample B at H02

2.5 實(shí)際樣品的純度檢測(cè)

根據(jù)真實(shí)性檢測(cè)的結(jié)果確認(rèn)H02位點(diǎn)可以被用于混雜樣品B的純度檢測(cè)。同時(shí)使用Sazz與Tradition啤酒花標(biāo)準(zhǔn)品按照100%、95%、90%、80%、60%、40%、0%的比例混合作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖7所示。圖7中黑色圈中的樣品為樣品B的檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性很好。標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光信號(hào)值見(jiàn)表4。樣品B的3次重復(fù)檢測(cè)熒光值見(jiàn)表5。通過(guò)表4的熒光值數(shù)據(jù)建立多元回歸方程，得到一次多項(xiàng)式：Saaz酒花所占比例Y=-0.736+0.464×A+0.669×B(A代表T基因型熒光值，B代表G基因型熒光值)，R值為0.939，模型擬合度高。說(shuō)明該模型能很好的對(duì)檢測(cè)樣品的純度進(jìn)行分析，過(guò)原點(diǎn)(陰性對(duì)照)做3個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果平均值做連線并與固定標(biāo)準(zhǔn)曲線相交，計(jì)算出交點(diǎn)的兩種基因型熒光值，帶入Y=-0.736+0.464×A+0.669×B中，得到最終測(cè)定結(jié)果為42.28%±2.5%。

圖7 H02位點(diǎn)樣品B純度檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The quantitative detection of Hop using H02 SNP marker

表4 H02位點(diǎn)固定曲線兩種基因型熒光信號(hào)值

Table 4 Two genotypes fluorescence signal values of fixed proportion curve at H02

基因型熒光值100%95%90%80%60%40%0%T3.71±0.023.04±0.022.76±0.022.32±0.021.50±0.010.90±0.01-0.31±0.01G0.18±0.010.34±0.020.50±0.010.65±0.020.90±0.021.00±0.021.40±0.01

表5 H02位點(diǎn)樣品B檢測(cè)結(jié)果兩種基因型熒光信號(hào)值

3 結(jié)論

本研究開(kāi)發(fā)了一套基于SNP分型技術(shù)對(duì)商業(yè)啤酒花顆粒進(jìn)行定性定量檢測(cè)的方法，并篩選出8個(gè)可以區(qū)分7個(gè)啤酒花品種的SNP位點(diǎn)。并利用篩選的8個(gè)SNP標(biāo)記可以準(zhǔn)確地對(duì)7種商業(yè)啤酒花顆粒進(jìn)行定性檢測(cè)。同時(shí)，確定了以固定質(zhì)量比例的方式對(duì)啤酒花顆粒進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，并對(duì)企業(yè)送檢樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，Sazz酒花樣品A純度大于95%，樣品B純度為42.28%±2.5%。本方法的建立為商業(yè)啤酒花顆粒品種的定性和定量檢測(cè)提供了全新的檢測(cè)方法。目前，關(guān)于啤酒花真實(shí)性檢測(cè)的報(bào)道還很少，且大多數(shù)的研究?jī)H限于理論上利用SNP方法分析酒花品種上，還沒(méi)有建立一套實(shí)際可行的檢測(cè)方法。本研究開(kāi)發(fā)了的檢測(cè)方法，既滿足了企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)檢測(cè)的需要，同時(shí)也完善了啤酒花品種的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，為釀酒原料的品種鑒定提供了一條全新的思路。

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