紅花籽粕氨基酸態(tài)氮酶法水解工藝優(yōu)化

魏娜，呂凱波（武漢工商學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，湖北武漢430065）

紅花籽，是紅花（Carthamus tinctorius L.）的種子，又被稱(chēng)作“白平子”[1]。紅花籽粕（safflower meal）是指從紅花籽中提取紅花籽油后得到的副產(chǎn)品[2]。紅花作為一種新型的油料作物，目前廣泛分布在世界20多個(gè)國(guó)家，其中在印度、加拿大等國(guó)產(chǎn)量最多[3-5]。紅花籽粕本身含有較高的粗蛋白和多種氨基酸，但是目前大多數(shù)只作為廉價(jià)的肥料和飼料，使蛋白質(zhì)等資源無(wú)法得到有效利用[6-7]。

氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。該含量越高，說(shuō)明產(chǎn)品中蛋白質(zhì)水解率越高，氨基酸含量越高，營(yíng)養(yǎng)越好[8-10]。隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及，食物蛋白質(zhì)中氨基酸含量的高低越來(lái)越得到人們的重視，為拓寬紅花籽粕綜合利用前景，本試驗(yàn)對(duì)酶法輔助紅花籽粕的水解工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮的含量，為日后紅花籽粕綜合利用及開(kāi)發(fā)功能性食品提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

紅花籽粕，產(chǎn)地中國(guó)。

1.1.2 儀器與試劑

電子天平：日本島津；HS-4（B）型恒溫浴槽：廣東佛山；722可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器、79-2磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；5810R離心機(jī)：德國(guó)艾本德（Eppendorf）股份公司；PB-21 pH計(jì)：德國(guó)Sartorius賽多利斯。

商業(yè)酶：胰蛋白酶（parenzyme，2 500 U/mg）、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（bacillus subtilis neutral protease，150 U/mg）、木瓜蛋白酶（papain，2 400 U/mg）購(gòu)自諾維信公司；所用試劑甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、無(wú)水硫酸鉀、NaOH、酚酞指示劑、鹽酸、中性紅指示劑等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的標(biāo)定[11]

用酸性的鄰苯二甲酸氫鉀（KHC8H4O4，相對(duì)分子質(zhì)量204.22）作為基準(zhǔn)物質(zhì)，可先準(zhǔn)確稱(chēng)量分析純的鄰苯二甲酸氫鉀3份，每份0.42 g，分別置于150 mL三角瓶，各加入20 mL無(wú)離子水，使全部溶解，加酚酞指示劑3~4滴，用待測(cè)的NaOH溶液滴定至淡紅色為止，記錄用去的NaOH的體積，求平均值，按下式計(jì)算得NaOH的標(biāo)準(zhǔn)濃度：

式中：m 為 KHC8H4O4的質(zhì)量，g；Mr為 KHC8H4O4的相對(duì)分子質(zhì)量；V為NaOH的滴定體積，mL。

1.2.1.2 甲醛滴定法[12-13]

移取2 mL抽濾的樣品溶液2份，分別置于250 mL的錐形瓶中，加水25 mL；其中一份加3滴中性紅指示劑，用上述標(biāo)定的NaOH滴定至琥珀色為終點(diǎn)。另一份加入中性甲醛10 mL及3滴百里酚酞指示劑，搖勻，靜置1 min，（此時(shí)藍(lán)色消失）。再用上述標(biāo)定過(guò)的NaOH溶液滴定至淡藍(lán)色。記錄兩次滴定所消耗的NaOH的毫升數(shù)，用下述公式計(jì)算。

式中：N為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃度，g/mL；V1為測(cè)定樣品消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為測(cè)定空白消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；W為樣品溶液相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 酶解反應(yīng)[14-18]

對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶分別進(jìn)行水解試驗(yàn)，并對(duì)以下幾個(gè)因素進(jìn)行考察。

1.2.2.1 料液比

在酶解溫度為45℃，酶用量為1%，作用時(shí)間為3 h時(shí)，每組均取5.00 g紅花籽粕，料液比分別為1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL），抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.2 酶用量

在酶解溫度為45℃，作用時(shí)間為3 h時(shí)，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，酶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%，抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.3 酶解溫度

酶用量為1%，作用時(shí)間為3 h，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，選取酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃，抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.4 作用時(shí)間

在酶解溫度為45℃，酶用量為1%，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，作用時(shí)間分別為 1、2、3、4、5 h 抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件和Design Expert 8.5數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮的影響

對(duì)3種不同酶分別水解紅花籽粕工藝條件的主要因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶分別水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮含量最高時(shí)料液比分別為 1 ∶3、1 ∶3、1 ∶3（g/mL）；酶用量分別為2%、2%、4%；酶解溫度分別為55、55、45℃；作用時(shí)間分別為 4、3、3 h。

2.2 最佳工藝條件的確定

2.2.1 胰蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同因素對(duì)3種酶分別水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of the single-factor experiments on the amino acid nitrogen of safflower meal

根據(jù)單因素結(jié)果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時(shí)間）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 胰蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by parenzyme

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序?yàn)椋篈（料液比）＞B（酶用量）＞D（酶作用時(shí)間）＞C（酶解溫度），結(jié)果表明：胰蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為A1B2C2D2，即料液比1∶3（g/mL）、酶用量為2%、酶解溫度為45℃、酶作用時(shí)間3.0 h，在此最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到7.7%。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素結(jié)果，以A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時(shí)間）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

續(xù)表2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序?yàn)椋篈（料液比）＞D（酶作用時(shí)間）＞B（酶用量）＞C（酶解溫度），結(jié)果表明：木瓜蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為 A1B2C2D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為2.0%、酶解溫度為55℃、酶作用時(shí)間4.0 h，在此最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到8.2%。

2.2.3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素結(jié)果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時(shí)間）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by bacillus subtilis neutral protease

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序?yàn)椋篊（酶解溫度）＞B（酶用量）＞D（酶作用時(shí)間）＞A（料液比），結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為A1B2C1D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2.0%、酶解溫度為 40℃、酶作用時(shí)間4.0 h，在此最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到4.27%。

3 結(jié)論

1）選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶3種商業(yè)酶分別水解紅花籽粕，胰蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為7.7%，木瓜蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為8.2%，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為4.27%，可知木瓜蛋白酶水解能力較強(qiáng)。

2）酶法水解最佳工藝條件分別為：①胰蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2%、酶解溫度為 45℃、酶作用時(shí)間3.0 h，氨基酸態(tài)氮含量7.7%；②木瓜蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2.0%、酶解溫度為55℃、酶作用時(shí)間4.0 h，氨基酸態(tài)氮含量8.2%。③枯草芽孢桿菌中性蛋白酶：料液比1∶3（g/mL）、酶用量為2.0%、酶解溫度為40℃、酶作用時(shí)間4.0 h，氨基酸態(tài)氮含量最高為4.27%。

[1] 楊玉霞,吳衛(wèi).不同品種(系)紅花籽粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2008,23(4):174-178

[2] 沈飛,夏明.紅花籽粕的綜合利用[J].今日科苑,2010(16):171

[3] 顧龔平,錢(qián)學(xué)射,張廣倫.燃料油植物紅花的綜合利用與栽培[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(5):14-18

[4] 王仁嬡.紅花籽油抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].河南中醫(yī),2008,28(2):28-29

[5] 夏明,麻辰韶.紅花籽粕水溶性蛋白的提取與氨基酸組成分析[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2009(9):41-43

[6] 董聰,李芳,王琳,等.紅花籽粕蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化[J].食品科技,2014(11):169-172

[7] 王瑛瑤,賈照寶,張霜玉.水酶法提油技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)油脂,2008,33(7):24-26

[8] 李楊,江連洲,楊柳.水酶法制取植物油的國(guó)內(nèi)外發(fā)展動(dòng)態(tài)[J].食品工業(yè)科技,2009,30(6):383-387

[9] Yusoff MM,Gordon MH,Niranjan K.Aqueous enzyme assisted oil extraction from oilseeds andemulsion de-emulsifying methods:a review[J].Trends in Food Science&Technology,2015,41(1):60-82

[10]江連洲,李楊,王妍,等.水酶法提取大豆油的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2013,34(9):346-350

[11]劉瑞興,張智敏,吳蘇喜,等.水酶法提取油茶籽油的工藝優(yōu)化及其營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2012,27(12):54-61

[12]孫紅,費(fèi)學(xué)謙,方學(xué)智.茶油水酶法提取工藝初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(3):597-601

[13]王超,方柔,仲山民,等.水酶法提取山茶油的工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2010(5):267-269

[14]Linh D Do,Travis L Stevens,TCG Kibbey,et al.Preliminary formulation development for aqueous surfactant-based soybean oil extraction[J].Industrial Crops&Products,2014,62:140-146

[15]Qing-Yan Gai,Jiao Jiao,Fu-Yao Wei,et al.Enzyme-assisted aqueous extraction of oil from Forsythia suspense seed and its physicochemical property and antioxidant activity[J].Industrial Crops&Products,2013,51(15):274-278

[16]Solmaz Tabtabaei,Levente L Diosady.Aqueous and enzymatic extraction processes for the production of food-grade proteins and industrial oil from dehulled yellow mustard flour[J].Food Research International,2013,52(2):547-556

[17]李波,宋江良,趙森,等.酶法提取香菇多糖工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(9):274-277

[18]吳建寶,寧程茜,胡傳榮,等.水酶法從冷榨油茶籽餅中提取油和蛋白的工藝研究[J].糧油食品科技,2015,23(6):34-39

[19]徐向宏,何明珠.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與Design-Expert、SPSS應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2010:90-98