滑子菇多糖提取工藝優化

朱振元，韓丹

（食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

食用菌是指子實體碩大、可供食用的大型真菌，通稱為蘑菇，多屬擔子菌亞門[1]。食用菌營養價值非常豐富，含有大量的蛋白質、核酸、碳水化合物、纖維素、維生素、礦物質等[2]。食用菌多糖具有抗氧化[3-5]、調節免疫力[6-8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖[11-12]、抑菌[13]等多種功效。研究報道表明，食用菌多糖現已廣泛應用于免疫缺陷性疾病和腫瘤等疾病的臨床輔助治療，被稱為一種重要的生物效應調節劑[14]。

滑子菇，又名珍珠菇、滑菇、真姬菇，因其表面附有一層黏液而得名，是集食用和藥用一體的菌類植物[15]。多糖是滑子菇重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力等生物活性。目前常用的提取方法有：熱水提取法、稀堿水溶液提取法和酶解法[16]，多糖是極性大分子，通常可用水做溶劑來提取，因為大部分活性多糖在低極性的有機溶劑中的溶解度較低，所以可用乙醇或丙酮沉淀粗提液中的活性多糖。為節省有機溶劑，對多糖提取液可先濃縮后沉淀。沉淀物再水洗、過濾或用離心機除去不溶物。因為操作方便，成本較低，所以該法是提取水溶性多糖最普遍的方法[17]。食用菌多糖的提取常常受提取時間、溫度、加水量等因素的影響，從而影響多糖的提取得率[18]。本文采用熱水浸提法提取多糖，通過單因素試驗考察提取溫度、提取時間以及料液比對滑子菇多糖提取得率的影響。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對多糖的提取條件進行優化從而確定滑子菇多糖的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮滑子菇：天津市濱海新區金元寶農貿市場，經烘干、粉粹后過60目篩得滑子菇干粉，用密封袋包好置于干燥器內。

1.2 主要設備

粉碎機：天津市康達電器有限公司；ESJ205-4型電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；循環水真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；真空干燥箱：上海益恒科技有限公司；DF-Ⅲ集熱式磁力加熱攪拌水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；ModeL 680酶標儀：Thermo ELectron U.S.A；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 滑子菇粗多糖提取工藝

1.3.1.1 滑子菇粉末的制備

取定量的新鮮滑子菇在95%乙醇中在室溫下浸泡24 h，以除去其大部分脂質。然后，將滑子菇烘干，用粉碎機粉碎，后過60目篩得滑子菇干粉，用密封袋包好置于干燥器內備用。

1.3.1.2 熱水浸提

取8 g干燥的滑子菇粉末放入500 mL燒杯中，在按1∶4（體積比）的比例加入320 mL蒸餾水，并在90℃的攪拌水浴中浸提2 h，以4 000 r/min離心10 min。濾渣重復該過程共3次，將濾液合并。

1.3.1.3 旋轉蒸發

用旋轉蒸發器在60℃下冷凝濃縮至150 mL。

1.3.1.4 乙醇沉淀

旋轉蒸發所得濃縮液加入4倍體積的95%乙醇溶液（體積比）醇沉24 h后，以4 000 r/min離心10 min，去除上清液，留沉淀。

1.3.1.5 Sevag法脫蛋白

醇沉得到的物質用Sevag法脫蛋白[19]，按多糖水溶液的1/5～1/4體積加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇為5∶1，體積比），振蕩混勻靜置直到水層和溶液層分層，去除水層和溶液層交界處的變性蛋白質，如此反復，直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

1.3.1.6 脫色

脫完蛋白的多糖溶液用大孔樹脂AB-8脫色[20]，將粗多糖溶液按體積比2∶1加入經預處理樹脂于50℃水浴鍋中水浴3 h進行脫色，并間隔攪拌，抽濾將樹脂除去，用少量水沖洗樹脂，合并的洗液即為經過脫色的多糖溶液，凍干得滑子菇粗多糖。

1.3.1.7 可溶性糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[21]測定總糖含量。

葡萄糖標準溶液的配制：取干燥至恒重的無水葡萄糖0.1 g，加蒸餾水溶解，然后將溶液轉移至100 mL容量瓶加水定容，獲得1 g/L的溶液，振搖均勻后從中用移液管量取10 mL，加入到另一支100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線，即得0.1mg/mL的標液。

葡萄糖標準曲線的繪制：分別取0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至 10 mL 具塞試管中，用蒸餾水補足1 mL，向各個試管中加入6%的苯酚溶液1 mL迅速加入5 mL濃硫酸搖勻，靜置10 min，沸水浴15 min，置于室溫冷卻，在490 nm處測吸光度OD值。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

樣品中總糖含量測定：精確稱取樣品，配成濃度為0.1 mg/mL的溶液，按上述方法測定樣品在490 nm處吸光度OD值，根據標準曲線計算總糖含量。

1.3.1.8 多糖提取得率的計算[22]

多糖提取得率/%=總多糖含量（g）/滑子菇粉末質量（g）×100

1.3.2 提取工藝優化

1.3.2.1 單因素試驗

1）提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，分別在不同的溫度（70、75、80、85、90℃）下提取，提取時間2 h、提取次數3次，4 000 r/min離心10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

2）提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，提取溫度80℃，分別提取提取時間 60、90、120、150、180 min，提取次數 3 次，4 000 r/min離心10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

3）料液比對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，提取溫度80℃，提取時間 2 h、料液比分別為 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1∶50（g/mL），提取次數 3次，4 000 r/min離心 10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

1.3.2.2 正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，確定各變量的水平取值，進行L9（33）的正交試驗，以滑子菇多糖提取得率為評價指標，考察各因素對滑子菇多糖提取得率的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal test

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響

提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.1 The influence of temperature on the extraction extraction rate

結果如圖1所示：當提取溫度從70℃至80℃時，滑子菇多糖的提取率隨提取溫度的升高而上升；當提取溫度從85℃至90℃時，滑子菇多糖提取得率明顯下降。溫度為80℃時，滑子菇多糖提取得率最大，為21.34%。多糖隨溫度變化的趨勢分析原因可能是溫度低于80℃時，隨著溫度的升高，加速了分子運動，多糖在水中的溶解度增大；當提取溫度超過80℃后，高溫提取會破壞多糖的結構影響其生物活性[23]，多糖分子結構鏈出現一定程度的降解，從而導致多糖提取得率下降。由試驗結果可確定最佳的提取溫度為80℃左右。

2.1.2 提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響

提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.2 The influence of time on the extraction rate

結果如圖2所示：當提取時間從60 min~120 min時，滑子菇多糖的提取率隨提取時間的增長而上升；當提取時間增長至150 min~180 min時，滑子菇多糖提取得率明顯下降。提取時間為120 min時，滑子菇多糖提取得率最大，為22.07%。提取時間過短時，滑子菇多糖無法充分溶出，延長提取時間，可使滑子菇中可溶性多糖溶解，從而使多糖提取得率上升。達到一定時間后，細胞內、外滲透壓逐步趨于平衡，多糖提取得率不再上升，加熱狀態下過長的時間可能導致多糖鏈結構發生變化，使多糖提取得率下降[24]。由試驗結果可確定最佳的提取時間在120 min左右。

2.1.3 料液比對滑子菇多糖提取得率的影響

料液比對滑子菇多糖提取得率的影響見圖3。

結果如圖3所示：當料液比從1∶30（g/mL）增大到1∶40（g/mL）時，滑子菇多糖的提取率逐漸增大。料液比為1∶40（g/mL）時，滑子菇多糖提取得率最大，為22.13%。繼續增大料液比，滑子菇多糖的提取得率基本保持平穩，幅度變化不明顯，隨著料液比的升高，多糖得率也會相應的增高；而當料液比過高時，多糖得率并未升高反而有所降低，可能是因為多糖能與水以任意比互溶，水量越多，后續工藝中的提取液的濃縮成本和醇沉中的乙醇用量就越多，提取液中多糖的濃度太低時，相同濃度的乙醇就越難以將多糖沉淀出來[25]。考慮后續試驗多糖提取液需濃縮，因此，確定最佳提取的料液比為1∶40（g/mL）左右。

圖3 料液比對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.3 The influence of liquid ratio on the extraction rate

2.2 正交試驗

由單因素試驗結果，確定各變量的水平取值，進行L9（33）的正交試驗。對試驗結果進行方差分析，試驗結果見表2、表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Orthogonal analysis of variance table

由表2、3可知，影響滑子菇多糖提取得率的各因素次序為B＞C＞A，3個因素中，即溫度對滑子菇多糖提取得率影響最大（P＜0.05），其次是料液比，最后為提取時間。最優提取工藝為A2B3C2，即提取溫度85℃，提取時間 2 h，料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.3 驗證試驗

在最佳工藝條件下進行提取多糖的驗證試驗，結果見表4。

表4 最佳工藝驗證試驗Table 4 The verification experiment of optimum extraction parameters

試驗結果表明：在最佳工藝條件下提取多糖，提取率達24.55%。

3 結論

本文以滑子菇為研究對象，對滑子菇多糖的提取條件進行了優化。通過正交試驗可知，3個因素中溫度對滑子菇多糖提取得率影響最大，其次是提取時間和料液比。并確定了熱水浸提滑子菇多糖的最佳提取條件是：提取溫度85℃，提取時間2 h，料液比1∶40（g/mL）。在此工藝條件下多糖的得率為24.55%。

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