花生粕酵解物及其美拉德產物的抗氧化性能分析

崔燕玲，張慧敏，袁楊，曾慶祝

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

花生仁經過壓榨提煉油脂后得到的產物叫花生粕，其粗蛋白質含量達48%以上，具有豐富的營養，含有多種氨基酸，尤其是甲硫氨酸和精氨酸的含量相當高，高達14.8%和5.2%[1]，具有良好的抗氧化作用[2]。近年來，利用發酵或酶解的方法分解花生粕蛋白制備抗氧化肽的研究成為熱點[3-5]，然而不同水解方法對花生粕蛋白水解程度不同，不能準確地得到某種抗氧化肽。這類抗氧化肽抗氧化性不穩定，而且儲存穩定性差，容易被破壞，難以實現工業化大量生產。因此，利用這類多肽和氨基酸合成具有抗氧化性的物質具有現實意義。

法國化學家L C Maillard在1912年發現甘氨酸和葡萄糖混合加熱的時候形成褐色物質，人們將此類反應命名為美拉德反應（Maillard reaction），又稱為非酶褐變反應。所謂美拉德反應是廣泛存在于食品工業的一種非酶褐變，是羰基化合物和氨基化合物間的反應，經過復雜的歷程，最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質類黑精或稱擬黑素，因此又稱羰氨反應[6]。研究發現，在啤酒、咖啡和焙烤食品里發現美拉德反應產物（Maillard reaction products，簡稱 MRPs）不但影響食品的色澤和風味，還具有較高的抗氧化性能，有關MRPs被用以代替酚類食用抗氧化劑，正逐漸引起人們的關注[7]。目前，MRPs已被看作功能食品的重要成分，具有抗氧化、抗變態、抗菌和抗細胞毒素等功能[8]。有研究表明，目前工業上常用的合成抗氧化劑丁基羥基茴香醚（Butyl hydroxy anisd，BHA）和二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等可能具有致癌性，許多國家已經禁止使用，而MRPs是食品加工與保藏過程中自身產生的一類物質，屬于天然物，其抗氧化性較強，目前已成為海內外抗氧化劑研究的熱點[9]。美拉德反應對食品的營養價值也有重要的影響，既可能由于消耗了食品中的營養成分或降低了食品的可消化性而降低食品的營養價值，也可能在加工過程中生成抗氧化物質而增加其營養價值。本文針對花生粕MRPs的抗氧化活性進行研究，以期為花生粕的高值化開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕：廣州市清石海食品有限公司；麩皮：廣州市番禺區北亭村農貿市場；木糖：鄭州康帆生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌：落星生物工作室；米曲霉（滬釀3.042）：上海佳民釀造食品有限公司；枯草桿菌蛋白酶（20萬 U/g）、纖維素酶（10萬 U/g）：南寧市龐博生物工程有限公司；α-淀粉酶（2 000 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基肼（DPPH）、二硫代巴比妥酸（TBA）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；水楊酸（分析純）：廣州化學試劑廠；鄰苯三酚、硫酸鐵、三氯乙酸（TCA）（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS：北京白洋醫療器械股份有限公司；恒溫震蕩培養箱HZQ-X100：上海天呈科技有限公司；高速冷凍離心機GL-2050MS：南京思歐儀器設備有限公司；水浴恒溫振蕩器THZ-82：金壇市華歐實驗儀器廠；數顯pH計PHS-25：上海精密科學儀器有限公司；雙光束分光光度計UV-2100：北京瑞利分析儀器公司；氣相色譜-質譜聯用儀7890A-5975C：美國Agilent科技公司。

1.3 花生粕酵解物美拉德反應產物制備工藝

花生粕酵解物及其美拉德反應產物制備流程圖見圖1。

圖1 花生粕酵解物及其美拉德反應產物制備流程圖Fig.1 The flow chart of peanut meal hydrolysates and its MRPs

花生粕在25 r/min下進行擠壓膨化，烘干粉碎。將其與麩皮、蒸餾水按7∶2∶135（質量比）的比例混合均勻，放入滅菌鍋中滅菌，冷卻至室溫后，先加入5%枯草芽孢桿菌，在30℃恒溫搖床中發酵4 h，再加入15%醬油曲精，繼續發酵48 h，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心15 min，得到花生粕發酵液和發酵渣[10]。發酵渣與蒸餾水1∶20（質量比）混合均勻，添加纖維素酶、中性淀粉酶和枯草桿菌蛋白酶（分別按10%、5%、4%的發酵渣重量添加）繼續酶解6 h，100℃滅酶10 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心15 min，得到花生粕發酵渣酶解液[11]。

花生粕發酵液與花生粕發酵渣酶解液1∶1（質量比）混合均勻，得到花生粕酵解物。添加1.0%木糖混合均勻，115℃反應35 min，得到花生粕酵解物美拉德反應產物（簡稱MRPs）。

1.4 花生粕酵解物及其MRPs抗氧化活性的測定

1.4.1 清除DPPH自由基的能力測定

[12]，配制濃度梯度的樣品稀釋液，取稀釋液2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，避光靜置20 min，在517 nm下測得Ai。用乙醇代替樣品液如上述方法測得AC。用2 mL無水乙醇取代DPPH乙醇溶液，測得Aj，計算清除率和樣品IC50值。樣品對DPPH自由基的清除率（Clearance rate，簡稱CR）計算公式如下：

注：IC50是樣品的DPPH自由基清除率為50%的樣品溶液稀釋液濃度。IC50數值小，表明樣品對DPPH自由基清除能力越強。下面3種抗氧化能力的IC50意義相同。

1.4.2 清除羥基自由基的能力測定

參考文獻[13]，配制濃度梯度的樣品稀釋液，取稀釋液2mL，加入2mL9mmol/LFeSO4溶液、2mL9mmol/L水楊酸-乙醇溶液和2 mL 8.8 mL H2O2溶液，37℃水浴30 min，在510 nm下測得A0。用蒸餾水代替樣品液如上述方法測得Ai0。用2 mL蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液，在510 nm下測得Ai，計算清除率和樣品IC50值。樣品對羥基自由基的清除率計算公式如下：

1.4.3 清除超氧化陰離子自由基的能力測定

參考文獻[13]，鄰苯三酚自氧化速率的測定方法：取pH8.2Tris-HCl緩沖液4.5mL，加入去離子水4.2mL，于25℃恒溫靜置20 min，取出后向混合體系迅速加入0.3 mL已預熱至25℃的3 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻，在325 nm波長下每隔30 s測吸光度1次，至4 min時停止，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加值（A1）。平行3組試驗，取其平均值。

加入樣品稀釋液后鄰苯三酚自氧化速率的測定方法：配制系列濃度范圍梯度的樣品稀釋液，取pH 8.2 Tris-HCl緩沖液4.5 mL，加入去離子水3.2 mL以及1.0 mL稀釋液，于25℃恒溫靜置20 min，取出后向混合體系迅速加入0.3 mL已預熱至25℃的3 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻，在325 nm波長下每隔30 s測吸光度1次，至4 min時停止，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加值（A2）。樣品對超氧化陰離子自由基的清除率計算公式如下：

1.4.4 抗脂質過氧化的能力測定

參考文獻[14]，配制系列濃度范圍梯度的樣品稀釋液，取1 g食用花生油，加入200 mg稀釋液和5 mL 2.8 g/L的TBA混勻，置于90℃恒溫烘箱中反應6 h，取出后加入5 mL100 g/L的TCA、2 mL CHCl3，充分搖勻后靜置10 min，取上清液，在532 nm下測吸光度（A）。以蒸餾水代替樣品不經烘箱處理后放置，用于分光光度計調零；以蒸餾水代替樣品，經過烘箱處理為空白組，吸光度記為A0。抗氧化活性用對油脂過氧化的抑制率（Inhibition ratio，IR）表示，如公式：

1.5 花生粕酵解物MRPs的GC-MS分析

氣相色譜-質譜分析條件：石英毛細管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.3 mL/min，分流比為10∶1，進樣溫度250℃，進樣量5 μL，總運行時間56 min；色譜柱升溫條件：初始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min升溫，最高柱溫270℃；質譜條件：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，質量掃描范圍10 U～600 U。

2 結果與分析

2.1 花生粕酵解物及其MRPs的抗氧化活性比較

2.1.1 花生粕酵解物及其MRPs清除DPPH自由基的能力比較

花生粕酵解物及其MRPs清除DPPH自由基能力比較見圖2。

圖2 花生粕酵解物及其MRPs清除DPPH自由基能力比較Fig.2 Comparison of DPPH scavenging ability of peanut meal hydrolysate MRPs and peanut meal hydrolysates

從圖2可看出，花生粕酵解物本身就具有一定的清除DPPH自由基能力，在發酵和酶解的過程中，蛋白質被水解成具有抗氧化能力的多肽和氨基酸，使其清除DPPH自由基的能力得到提升。但是在0.5 mg/mL~3.0 mg/mL質量濃度范圍中，MRPs清除DPPH自由基能力明顯強于花生粕酵解物。隨著MRPs樣品質量濃度增大，MRPs對DPPH自由基的清除率逐漸增大，且當其樣品質量濃度為3.0 mg/mL時，清除率達到70%，顯示出MRPs在給定濃度范圍內對DPPH自由基有較強的清除能力，且其清除能力都強于花生粕酵解物。這是由于酵解物在進行美拉德反應時，合成或者分解得到更多的具有抗氧化能力的物質[15]，使得其MRPs清除DPPH自由基的能力得到較大的提升。

2.1.2 花生粕酵解物及其MRPs清除羥基自由基的能力比較

花生粕酵解物及其MRPs清除羥基自由基的能力比較見圖3。

圖3 花生粕酵解物及其MRPs清除羥基自由基的能力比較Fig.3 Comparison of scavenging hydroxyl radical capacity of peanut meal hydrolysate MRPs and peanut meal hydrolysates

由圖3可知，在0.5 mg/mL～6.0 mg/mL質量濃度范圍內，MRPs清除羥基自由基的能力比花生粕酵解物強。隨著MRPs樣品質量濃度增大，MRPs對羥基自由基的清除率逐漸增大，且當其樣品質量濃度大于4.0mg/mL，清除率達到90%并趨于平緩。這說明MRPs在給定濃度范圍內對羥基自由基有較強的清除能力。

2.1.3 花生粕酵解物及其MRPs清除超氧化陰離子自由基的能力比

花生粕酵解物及其MRPs清除超氧化陰離子自由基的能力比較見圖4。

通過試驗得到圖4，在30 mg/mL～60 mg/mL質量濃度范圍中，MRPs清除超氧化陰離子自由基的能力明顯優于花生粕酵解物，隨著MRPs樣品質量濃度增大，MRPs對超氧化陰離子自由基的的清除率逐漸增大，且當MRPs樣品質量濃度大于50 mg/mL，清除率達到75%趨于平緩。這說明高濃度的MRPs對超氧化陰離子自由基有較強的清除能力。

2.1.4 花生粕酵解物及其MRPs抗脂質過氧化的能力比較

花生粕酵解物及其MRPs抗脂質過氧化的能力比較見圖5。

圖4 花生粕酵解物及其MRPs清除超氧化陰離子自由基的能力比較Fig.4 Comparison of scavenging superoxide anion radical capacity of peanut meal hydrolysate MRPs and peanut meal hydrolysates

圖5 花生粕酵解物及其MRPs抗脂質過氧化的能力比較Fig.5 Comparison of resisting lipid peroxidation ability of peanut meal hydrolysate MRPs and peanut meal hydrolysates

通過試驗得到圖5，在5 mg/mL～30 mg/mL質量濃度范圍中，MRPs抗脂質過氧化能力明顯優于花生粕酵解物，且MRPs隨著樣品質量濃度增大，MRPs抗脂質過氧化的能力逐漸增大，且當MRPs樣品質量濃度大于30 mg/mL時，清除率達到90%趨于平緩。這說明MRPs抗脂質過氧化的能力較強。

2.1.5 MRPs的抗氧化性能力的IC50值

花生酵解物美拉德反應產物MRPs的抗氧化性能力的回歸方程及IC50如表1。

表1 MRPs的抗氧化性能力Table 1 Antioxidant activity of peanut meal hydrolysate MRPs

由表1可得，MRPs對3種自由基均有一定的清除能力，且具有抗脂質過氧化能力。計算4種抗氧化能力IC50值可得，抗氧化能力大小比較如下，清除DPPH自由基能力＞清除羥基自由基＞抗脂質過氧化＞清除超氧化陰離子自由基。由此可得，花生酵解物美拉德反應產物清除DPPH自由基能力最強，IC50值為1.93 mg/mL，其次是清除羥基自由基，IC50值為2.09 mg/mL。

2.2 花生粕酵解物及其MRPs的GC－MS分析

對花生粕酵解物和花生粕酵解物MRPs分別進行GC－MS分析，得到兩個樣品的總離子圖，如圖6和圖7。

圖6 花生粕酵解物的總離子圖Fig.6 The total ion chromatography of peanut meal hydrolysates

圖7 花生粕酵解物MRPs的總離子圖Fig.7 The total ion chromatography of MRPs from peanut meal hydrolysates

經由NIST14.L譜庫檢索分析鑒定得到各組分及其含量。其中包括氮硫化合物、酸類、烴類及酚類。分析其主要成分相對百分含量，匯總得到表2。

對比表2中各抗氧化性成分可見，在花生粕酵解物中，抗氧化成分：吡咯[1，2－a]吡嗪－1，4－二酮含量為3.15%、油酸為1.99%，但不含氫化肉桂酸和對羥基苯乙醇。在花生粕酵解物美拉德產物中，4種抗氧化成分及其含量為：吡咯[1，2－a]吡嗪－1，4－二酮含量為 5.56%、油酸為2.87%、氫化肉桂酸為2.47%、對羥基苯乙醇為2.40%，這4種抗氧化成分經過美拉德反應后，其含量都增加了，說明美拉德反應可促進抗氧化物質的生成[16－19]。2，6－二叔丁基對甲酚是工業中經常使用的抗氧化劑BHT，具有良好的抗氧化能力[20]，花生粕酵解物中含量為26.68%，花生粕酵解物美拉德產物中含量為26.83%，二者含量接近，美拉德反應對該物質含量的影響不大。綜上分析可知，美拉德反應通過生成多種具有抗氧化性的物質，可有效增強花生粕酵解物的抗氧化性。

表2 花生粕酵解物及其MRPs成分對比及成分特征Table 2 Comparison of components and components characteristic of peanut meal hydrolysates around the maillard reation

續表2 花生粕酵解物及其MRPs成分對比及成分特征Continue table 2 Comparison of components and components characteristic of peanut meal hydrolysates around the maillard reation

3 結論

本試驗選用花生粕為原料，制取花生粕酵解物并在最佳反應工藝參數條件下進行美拉德反應得到MRPs，并就花生粕酵解物及其MRPs的抗氧化活性進行分析比較。具體試驗結論如下：

1）花生粕酵解物及其MRPs均具有抗氧化性，花生粕酵解物經過美拉德反應，其產物的抗氧化性更顯著，主要體現在對DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力、超氧化陰離子自由基的清除能力及抗脂質過氧化能力。且通過對比MRPs對不同自由基的清除能力，得到清除DPPH自由基能力＞清除羥基自由基能力＞抗脂質過氧化能力＞清除超氧化陰離子自由基能力；

2）通過GC－MS分析發現，花生粕酵解物及其MRPs的抗氧化成分及其含量有較大差異，其中MRPs中具有抗氧化活性的物質含量明顯多于花生粕酵解物，說明通過美拉德反應可增強花生粕酵解物的抗氧化活性。

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