人類血小板因子Ⅳ水平與惡性瘧原蟲感染的關(guān)系

謝東德 陳江濤 Urbano Monsuy Eyi Rocio Apicante Matesa Maximo Miko Ondo Obono Carlos Sala Ehapo 李瑩 梁雪雁 林敏

1江門市人民醫(yī)院檢驗科（廣東江門529000）；2廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊（廣州510000）；3惠州市中心醫(yī)院檢驗中心（廣東惠州516001）；4馬拉博地區(qū)醫(yī)院檢驗科（馬拉博，赤道幾內(nèi)亞共和國）；5汕頭大學醫(yī)學院組織胚胎教研室（廣東汕頭515000）

瘧疾是一種由瘧原蟲感染引起的嚴重危害人體的全球性疾病，全世界每年約有1億的臨床病例，約110余萬人死于該病，其中大部分死亡病例發(fā)生在非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)［1］。眾所周知，與其他的許多感染性疾病一樣，自身的遺傳因素能夠影響人體對于瘧疾感染的風險。人類血小板因子Ⅳ（PF4）能夠活化血小板，使血小板與紅細胞表面的Duffy抗原結(jié)合，從而殺傷紅細胞里面的瘧原蟲［2-3］，達到降低宿主腦型瘧的風險的作用［4-5］。筆者在參加援非醫(yī)療隊期間工作于赤道幾內(nèi)亞共和國馬拉博地區(qū)醫(yī)院，對許多疑似瘧疾患者作過瘧原蟲檢查，同時對部分瘧疾患者作過PF4檢測，旨在探討瘧原蟲感染與PF4的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域 比奧科島（Bioko Island），原名“費爾南多波島”（Fernando Poo），是非洲幾內(nèi)亞灣中最大的一個火山島，屬赤道幾內(nèi)亞管轄，隔海與尼日利亞和喀麥隆相望。該島面積為2 017平方公里，島上最高點3 012 m，人口約266 000萬人，屬于潮濕的熱帶雨林氣候，是全球瘧疾感染最嚴重的地區(qū)之一。盡管赤道幾內(nèi)亞政府在該島實施瘧疾防治計劃（Bioko Island Malaria Control Project，BIMCP），以中國為代表的國際社會派遣醫(yī)療隊參與了當?shù)氐寞懠卜揽匾呀?jīng)取得明顯的效果，但瘧疾仍然是該島的一個重大的公共衛(wèi)生問題。該島的昆蟲學接種率（entomological inoculation rates，EIRs）為163 ～ 830，戶外EIRs超過900，超過52%的感染者為5歲以下的兒童［6］。

1.2 研究對象 本研究開展于2012-2014年筆者參與廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊期間，所有計劃獲得赤道幾內(nèi)亞馬拉博地區(qū)醫(yī)院（Malabo Re?gional Hospital）倫理委員會的批準，并同時取得患者/監(jiān)護人的知情同意。隨機抽取2013年雨季（當?shù)丿懠沧顬閲乐貢r間段）門診患者，按照瘧疾的感染情況將研究對象分為兩組：（1）瘧疾組：馬拉博地區(qū)醫(yī)院收治的瘧原蟲感染者（黑人），共122例，其中男66例，女58例，年齡在2～63歲之間，平均（26.3±5.6）歲；（2）正常對照組：無近期病史的人，共399例，其中男189例，女210例，年齡在2～74歲之間，平均（23.5±4.7）歲。

1.3 樣本采集 采用無抗凝劑真空管采集每名收試者靜脈血3 mL，同時按照國家行業(yè)標準制備薄血膜和厚血膜［7］。其次，將3 mL靜脈血靜置凝固后，在2 h內(nèi)采用3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min分離血清，并將血清置于1.5 mL離心管-20℃冷凍保存待用。

1.4 瘧原蟲檢測及蟲種鑒定 采用WHO推薦的白細胞瘧原蟲計數(shù)法，在油鏡下對吉姆沙染色后血涂片進行鏡檢［8］；按照本實驗室以往建立定量PCR及熔解曲線的方法進行蟲種鑒定，同時以四種瘧原蟲（間日瘧原蟲，Plasmodium vivax；三日瘧原蟲，Plasmodium malariae；卵形瘧原蟲，Plasmodium ovale；惡性瘧原蟲，Plasmodium falciparum）的標準質(zhì)粒作為對參照物［9］。

1.5 PF4濃度檢測 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測，試劑系美國R&D的人類血小板因子4（PF?4/CXCL?4）ELISA檢測試劑盒，全程嚴格按照試劑使用說明書進行操作。大致步驟是：（1）分離出患者的血清標本；（2）標準品的稀釋與加樣及患者標本加樣等酶標檢測操作；（3）在酶標儀以空白孔調(diào)零，450 nm波長依順序測定各孔的吸光度（OD值）；（4）以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪制出標準曲線，根據(jù)患者標本的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的PF4濃度；（5）以PF4標準品濃度為0時的OD值為界定值用以確定患者及獻血者的PF4水平屬于陰性還是陽性，筆者擬定≤0時的OD值為陰性、＞0時的OD值為陽性。PF4濃度單位為μg/L。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用IBM@SPSS Statistics Version 13.0統(tǒng)計軟件。用頻數(shù)分布曲線來檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若偏度系數(shù)（Skew?ness）和峰度系數(shù)（Kurtosis）均＜ 1，可認為近似于正態(tài)分布；若Skewness和Kurtosis均＞1，即認為數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)（P25～P75）來描述。采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗（Mann?WhitneyU）比較瘧疾組與對照組的PF4水平。用非條件的Logistic回歸進行單因素和多因素分析。比值比（OR）和調(diào)整OR（AOR）用95%的置信區(qū)間表示（95%CI），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瘧疾感染情況 所有樣本用WHO法和熒光定量PCR?熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)導致該地區(qū)瘧疾均是惡性瘧原蟲，瘧原蟲密度不符合正態(tài)分布：21 335（4 065 ～ 91 800）個/μL，（Skewness=2.755和Kurtosis=8.266均＞1）。如表1所見，年齡是人群的瘧疾感染瘧疾感染的強烈的相關(guān)因素，其中兒童組和少年組的瘧疾感染率均高于成人組的感染率，兩者與成人組比較，存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05，表1）。但不同性別的比較，兩者之間不存在統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 不同年齡和性別的瘧疾感染風險性評估Tab.1 Risk assessment of malaria infection at different age and sex 例

2.2 瘧疾組與對照組PF4均值和PF4陽性率比較 如表2所示，PF4水平在瘧疾組與對照組均不符合正態(tài)分布，瘧疾組略高于對照組，經(jīng)兩獨立樣本非參數(shù)檢驗（Mann?WhitneyU），發(fā)現(xiàn)Z=-2.07，P=0.038，兩者之間存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

根據(jù)PF4的參考范圍，將瘧疾陽性組劃分為High組（PF4水平高于正常）和Normal組（PF4水平處于正常范圍）。我們發(fā)現(xiàn)，兩組的瘧原蟲密度基本處于同一范圍，結(jié)果如圖1所示，兩者之間無存在統(tǒng)計學差異（P=0.657）。

表2 2組PF4均值和PF4陽性率比較Tab.2 Comparison of PF4 mean and PF4 positive rate between 2 groups

圖1 PF4水平和瘧原蟲密度圖Fig.1 PF4 levels and Plasmodium density maps

3 討論

在非洲許多國家，瘧疾被稱為“頭號殺手”［10］。赤道幾內(nèi)亞共和國位于非洲中西部，是全球50個最不發(fā)達國家之一，屬熱帶雨林氣候，國家的衛(wèi)生和經(jīng)濟條件差，為瘧疾的高發(fā)區(qū)，其中兒童瘧疾占相當大比例，而兒童瘧疾病例以惡性瘧原蟲感染為主，尤其是＜5歲兒童感染瘧疾的死亡率高［11］。由于大部分抗瘧藥物逐漸出現(xiàn)的耐藥性以及開發(fā)有效疫苗是一個長期過程，因此研究瘧疾的發(fā)病機制以及宿主對感染作出的反應(yīng)顯得尤為緊迫。

血漿PF4增高表示血小板被激活及其釋放反應(yīng)亢進，常見于血栓前狀態(tài)和血栓栓塞性疾病。因此，盧亞敏等［12］研究揭示冠心病患者PF4水平較正常組升高，膽固醇水平可能通過影響PF4的水平促進冠心病的發(fā)生，且與冠心病病情程度相關(guān)。MCMORRAN等［2］認為PF4激活血小板后，可使血小板與紅細胞表面的Duffy抗原相結(jié)合，通過結(jié)合感染的細胞及殺死其內(nèi)部的寄生蟲來限制紅細胞內(nèi)的瘧原蟲的繁殖。最近很多研究也顯示PF4、紅細胞表達的Duffy抗原、抗瘧素因子在血小板殺死瘧原蟲能力中發(fā)揮重要作用［13］。與1983年Essien EM和Ebhota MI在尼日利亞的研究一致［14］，本研究發(fā)現(xiàn)，瘧疾組的PF4水平明顯高于對照組（P＜0.05），揭示人體感染瘧原蟲后，血液中的PF4水平可應(yīng)激性升高，通過與感染的紅細胞結(jié)合來殺死其內(nèi)的瘧原蟲。而PF4和紅細胞Duffy抗原受體（Fy）結(jié)合是血小板殺死瘧原蟲的關(guān)鍵。PF4與感染的紅細胞接觸后，必須依賴與之結(jié)合的Fy受體，定位于紅細胞內(nèi)瘧原蟲的消化泡（DV）并導致細胞器的特定溶解和瘧原蟲的死亡，由此可見PF4是一個獨特的例子，它是一種由宿主衍生能直接殺滅原蟲的趨化因子。但令人困惑的是，我們的實驗未發(fā)現(xiàn)PF4高水平組和正常水平組之間的惡性瘧原蟲密度的存在差異，可能與受感染紅細胞表達的Duffy抗原受體（Fy）的數(shù)量有關(guān)，PF4與Fy復合物如何定位瘧原蟲以及進入瘧原蟲的復雜分子機制亦還有待證明。由于未有更詳細的相關(guān)研究報道，這有待于我們?nèi)ヒ贿M步擴大標本的數(shù)量，以期找到一個更有說服力的結(jié)果。

該研究的目的是為了了解血小板介導的瘧原蟲殺滅機制，為瘧疾治療提供思路。前人的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血小板在抵抗瘧原蟲過程中起到了一定的作用，本次研究拓展了前人的研究，進一步探索PF4和Fy等關(guān)鍵物質(zhì)在該過程中發(fā)揮的作用。

［1］SNOW R W，GUERRA C A，NOOR A M，et al.The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum ma?laria［J］.Nature，2005，434（7030）：214?217.

［2］McMORRAN B J，WIECZORSKI L，DRYSDALE K E，et al.Platelet factor 4 and Duffy antigen required for platelet killing of Plasmodium falciparum［J］.Science，2012，338（6112）：1348?1351.

［3］LOVE M S，MILLHOLLAND M G，MISHRA S，et al.Platelet factor 4 activity against P.falciparum and its translation to non?peptidic mimics as antimalarials［J］.Cell Host Microbe，2012，12（6）：815?823.

［4］SRIVASTAVA K，COCKBURN I A，SWAIM A，et al.Platelet factor 4 mediates inflammation in experimental cerebral malaria［J］.Cell Host Microbe，2008，4（2）：179?187.

［5］SRIVASTAVA K，F(xiàn)IELD D J，AGGREY A，et al.Platelet fac?tor 4 regulation of monocyte KLF4 in experimental cerebral ma?laria［J］.PLoS One，2010，5（5）：e10413.

［6］LI J，CHEN J，XIE D，et al.Limited artemisinin resistance?as?sociated polymorphisms in plasmodium falciparum K13?propel?ler and PfATPase6 gene isolated from Bioko Island，Equatorial Guinea［J］.Int J Parasitology.Drugs and drug Resistance，2016，6（1）：54?59.

［7］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.WS 259?2015瘧疾的診斷［S］.北京：中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，2015.

［8］LI J，CHEN J，XIE D，et al.Molecular mutation profile of Pf?crt and Pfmdr1 in Plasmodium falciparum isolates from Bioko Is?land，Equatorial Guinea［J］.Infect Genet Evol，2015，36：552?556.

［9］陳江濤，劉配芬，鐘德善，等.SYBR GreenⅠ染料法定量PCR檢測瘧原蟲感染及鑒別蟲種的研究［J］.分子診斷與治療，2013，5（4）：225?229.

［10］World Health Organization.World Malaria Report［J］，2010.Ge?neva：Switherland，2010：1?63.

［11］張麗蓉，潘雪峰，鐘德善，等.非洲赤道幾內(nèi)亞兒童瘧疾感染實驗室檢測及臨床診治分析［J］.中國熱帶醫(yī)學，2016，16（2）：155?158.

［12］盧亞敏，霍麗靜，張明明，等.冠心病患者高膽固醇血癥與血漿血小板因子4及β?血小板球蛋白的關(guān)系［J］.實用老年醫(yī)學，2016，30（2）：108?110.

［13］McMORRAN B J，BURGIO G，F(xiàn)OOTE S J.New insights into the protective power of platelets in malaria infection［J］.Comuni?cative and integrative biology，2013，6（3）：e23653

［14］ESSIEN E M，EBHOTA M I.Platelet secretory activities in acute malaria（Plasmodium falciparum） infection［J］.Acta Haematol，1983，70（3）：183?188.