小兒特發(fā)性心肌病91個心肌病相關(guān)基因檢測分析

張力力 王樹水 辛穎 張智偉 李渝芬

1南方醫(yī)科大學(xué)（廣州 510515）；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所心兒科（廣州 510080）

特發(fā)性心肌病是原發(fā)于心肌病變的心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常，包括擴(kuò)張型心肌病（dilated cardio?myopathy，DCM）、肥厚型心肌病（hypertrophic car?diomyopathy，HCM）、左室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）等。DCM表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大，心室收縮功能減退，伴或不伴有充血性心力衰竭，常有心律失常，可伴發(fā)栓塞、猝死等并發(fā)癥。HCM是以不能解釋的心室肥厚為特征的心肌疾病，早期伴心臟舒張功能不全，晚期收縮功能亦受影響，左室流出道梗阻是該病的常見特征，它是最常見的年輕人心源性猝死的原因之一。LVNC是以心室內(nèi)疏松的肌小梁和深陷的隱窩為特征的心肌病，常累積左室，又稱海綿狀心肌、竇狀心肌持續(xù)狀態(tài)等。近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，從基因?qū)用嬖\斷疾病，分析基因突變與臨床表型的關(guān)系已成為研究熱點［1］。本文對我院接診的43例無血緣關(guān)系的特發(fā)性心肌病兒科患者進(jìn)行心肌病相關(guān)基因進(jìn)行研究，系首次對特發(fā)性心肌病患兒進(jìn)行多達(dá)91個心肌病相關(guān)基因的測序分析，以明確特發(fā)性心肌病患兒致病基因及其突變特點，初步分析基因突變與臨床表型的關(guān)系，探討基因突變在心肌病診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療方面的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 廣東省人民醫(yī)院從2015年1月至2017年3月共收治43例無血緣關(guān)系心肌病患兒（DCM 14例，HCM12例，LVNC17例），全部病例經(jīng)酶學(xué)及串聯(lián)質(zhì)譜檢查等排除代謝性心肌病，經(jīng)臨床、超聲心動圖檢查確診。DCM中，男8例，女6例，年齡0.3～14（6.4±5.4）歲。HCM中，男4例，女8例，年齡0.3～14（6.3±4.9）歲。LVNC中，男7例，女10例，年齡0.2±13（4.0±4.5）歲。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，所有患兒及直系親屬，均由其本人或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 基因測序分析

1.2.1 二代基因測序 抽取靜脈血2 mL，采用QIAamp DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）抽提基因組DNA。提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法進(jìn)行純化，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接上接頭序列，使用 TruSight One Sequencing Panel（illumina Inc，USA）試劑盒經(jīng)2次捕獲及純化，再經(jīng)PCR擴(kuò)增和純化后獲得的最終文庫在Nextseq500測序儀（illumina Inc，USA）上進(jìn)行外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交接區(qū)的二代測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)既往文獻(xiàn)報道［2-4］和HGMD（Human Gene Mutation Database）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Men）等數(shù)據(jù)庫選取與心肌病相關(guān)或可能相關(guān)的91個基因進(jìn)行分析。該91個基因為 AARS2、ABCC9、ACTC1、ACTN2、AGK、ANKRD1、BAG3、CALR3、CASQ2、CAV3、CHRM2、COX15、 CRYAB、 CSRP3、 CTF1、 DES、 DMD、DNAJC19、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、ELAC2、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、FLT1、FOXD4、FXN、GATAD1、GLA、ILK、ISL1、JPH2、JUP、KLF10、LAMA2、LAMA4、LAMP2、LDB3、LMNA、MAP2K2、MRPL3、MTO1、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYO6、MYOM1、MYOZ2、MYPN、NDUFAF1、NDUFS7、NEBL、NEXN、PDLIM3、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、RYR2、SCN5A、SGCA、SGCD、SLC25A3、SLC25A4、SRI、SYNE1、SYNM、TAZ、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、TXNRD2、VCL。用BWA算法比對到參考序列（UCSC hg19），采用儀器默認(rèn)設(shè)置，使用ANNOVAR工具對數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。使用千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選、注釋；使用SIFT、Polyphen?2軟件進(jìn)行錯義變異的生物信息學(xué)分析。綜合各個基因變異的頻率、基因功能、遺傳方式、文獻(xiàn)報道等信息，并結(jié)合患兒的臨床表型信息，篩選候選突變。根據(jù)2015年“美國遺傳學(xué)與基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）”提出的指南得出致病性判斷，基因突變的致病性程度分為5檔，即致病突變、可疑致病突變、臨床意義未明、可能無害、無害［5］。

1.2.3 Sanger測序驗證 針對候選突變的位點，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，對其中收集到靜脈血的一代親屬進(jìn)行相應(yīng)位點的Sanger測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 特發(fā)性心肌病基因突變情況 43例患兒（DCM 14例，HCM 12例，LVNC 17例）中，20例（46.5%）檢測到 ACTC1、DSG2、ELAC2、FKTN、HCN4、LAMA2、LMNA、MTO1、MYBPC3、MYH6、MYH7、NEBL、NEXN、NKX2?5、PLN、PSEN2、RAF1、SCN5A、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL等 23個基因上的致病突變和可疑致病突變，共檢測到28個致病突變或可疑致病突變位點，未見有重復(fù)出現(xiàn)的突變位點（表1）。其中6例患兒同時檢測到2個基因上致病突變或可疑致病突變，2例患兒同時檢測到1個基因的2個致病突變或可疑致病突變。對其中24個突變位點進(jìn)行父母測序驗證發(fā)現(xiàn)，由父或母遺傳的有19個，新發(fā)突變5個。致病突變和可疑致病突變中，突變方式以錯義突變?yōu)橹鳎?0.0%，其次為移碼突變（17.8%）、無義突變（14.3%）、剪接突變（10.7%）、外顯子和內(nèi)含子交接區(qū)的微小缺失突變（3.5%）。此外，19例（44.1%）患兒檢測到臨床意義未明的突變位點。

2.2 DCM與基因突變 14例DCM患兒中，5例（35.7%）檢測到7個基因上的8個致病突變及可疑致病突變位點，余9例均檢測到臨床意義未明的突變。1例DCM患兒中檢測到FKTN基因上的2個位點的突變，F(xiàn)KTN?L166P來自于父親，F(xiàn)KTN?F369fs來自于母親，父母均無心臟擴(kuò)大或心力衰竭的表現(xiàn)，但該患兒就診時即有嚴(yán)重的心力衰竭。

2.3 HCM與基因突變 12例HCM患兒中的7例（58.3%）檢測到10個基因上的11個致病及可疑致病突變位點，3例檢測臨床意義未明的突變。對其中1例有暈厥史，且就診2年后因心力衰竭死亡的患兒（病例17，圖1）進(jìn)行家系分析發(fā)現(xiàn)，其母親、妹妹、外婆攜帶致病突變MYH7?R663C，其父親、伯父攜帶可疑致病突變MYH7?R1050*，均未患病，其姐姐診斷為HCM已于4歲猝死，未能檢測到其姐姐基因。1例患兒父親不明原因猝死，后發(fā)現(xiàn)該患兒心肌肥厚且檢測到致病突變TNNT2?R130C，患兒母親未攜帶此突變。還有1例HCM患兒檢測到PKP2基因上的R284G位點突變，該位點根據(jù)ACMG指南判斷為臨床意義未明，但通過患兒家系驗證發(fā)現(xiàn)，該位點為新發(fā)突變，其父、母均未攜帶此突變位點。

表1 特發(fā)性心肌病基因型與臨床表型Tab.1 Genotype and phenotype of cadiomyopathy

2.4 LVNC與基因突變 在17例LVNC的患兒中，8例（47%）檢測到9個基因上的9個致病及可疑致病突變位點。7例檢測到臨床意義未明的突變，2例患兒僅檢測到無害和可能無害的突變位點。對1例（病例9，圖2）患兒進(jìn)行家系分析發(fā)現(xiàn)，該患兒攜帶的突變ACTC1?c.616+1G＞C為新發(fā)突變，其兄長、父、母均不攜帶此突變。1例合并有竇性心動過緩的患兒檢測到致病突變HCN4?G482R。

3 討論

本文首次對特發(fā)性心肌病患兒進(jìn)行多達(dá)91個心肌病相關(guān)基因的測序分析，明確特發(fā)性心肌病患兒致病基因及其突變特點，初步分析基因突變與臨床表型的關(guān)系，探討基因突變在心肌病診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療方面的作用。研究發(fā)現(xiàn)DCM與48個基因的突變有關(guān)，40%～50%的家族性DCM可以檢測到基因突變［6］，其中最常見的突變基因為TTN，約占20%，其次為LMNA（6%），MYH7（4.2%），MYH6（3 ～ 4%），SCN5A（2 ～ 4%）等［7］，本研究中14例DCM患兒中5例檢測到致病基因突變和可疑致病突變，大部分為非家族性的DCM，我們檢測到常見基因LMNA，還檢測到TPM1、VCL、PLN、DSG、PSEN2、FKTN 等致病基因。在HCM中，已經(jīng)報道了26個致病基因，50%～60%的家族性HCM，20%～30%的非家族性HCM可以檢測到基因突變［8］。研究表明在HCM的致病基因中 MYH7、MYBPC3約各占 40%，TNNI3、TNNT2約各占 5%，TPM1約占 2%［9］，本研究在12例HCM患兒中7例檢測到致病突變及可疑致病突變。我們也同樣檢測到MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3上的突變位點，與文獻(xiàn)報道相符。此 外 ，還 檢 測 到 TTN、RAF1、PSEN2、LAMA2、NEXN、MTO1等基因的突變位點。LVNC與15個基因突變相關(guān)，15% ～50%的LVNC為家族遺傳［10］。常見的LVNC致病基因有DTNA、MIB1、PRDM16、TNNT2、TAZ等［11］。本研究檢測到的致病基因包括 ACTC1、ELAC2、HCN4、LMNA、MYH6、NEBL、NKX2?5、SCN5A、TTN。

圖1 1例HCM患兒超聲心動圖及基因測序圖Fig.1 Images for a patient of HCM

圖2 1例LVNC患兒超聲心動圖及基因測序圖Fig.2 Images for a patient of LVNC

根據(jù)既往文獻(xiàn)報道和相關(guān)數(shù)據(jù)庫選擇了與心肌病相關(guān)或可能相關(guān)的91個基因進(jìn)行測序分析［1-3］。在本研究的43例特發(fā)性心肌病患兒中，20例（46.5%）檢測到致病或可疑致病突變位點，19例（44.1%）檢測到目前臨床意義尚未明確的突變位點。這些研究結(jié)果提示，將心肌病相關(guān)基因檢測用于協(xié)助診斷特發(fā)性心肌病是可行的。特發(fā)性心肌病患兒中大部分都能檢測到突變位點，但其中存在臨床意義未明的位點，我們的研究結(jié)果顯示，這些臨床意義目前尚未明確的突變位點很可能與患兒的發(fā)病密切相關(guān)，需要今后進(jìn)一步的分析。本研究中，1例HCM患兒檢測到PKP2基因上的R284G位點突變。雖然根據(jù)目前的判斷標(biāo)準(zhǔn)，該突變尚定義為臨床意義未明的突變位點，但該位點為新發(fā)突變，具有較強(qiáng)的致病證據(jù)，很可能與HCM發(fā)病相關(guān)。在既往研究中，PKP2?R284位點未見有引起HCM的報道，但PKP2基因的突變影響橋粒功能，是引起右室心肌病的常見致病基因，因而我們懷疑R284G為新發(fā)現(xiàn)的HCM的致病位點，需要進(jìn)行下一步的驗證。

文獻(xiàn)報道，部分基因突變位點與病變程度相關(guān)。有研究結(jié)果顯示攜帶一個基因上的雙突變位點是患兒預(yù)后不良的標(biāo)志［12-13］。本研究中1例DCM患兒攜帶FKTN的雙突變位點，其分別來自于父母，該患兒父母無心臟擴(kuò)大或心力衰竭等表現(xiàn)，但患兒就診時即有嚴(yán)重的心力衰竭，且治療后未見明顯好轉(zhuǎn)，支持其預(yù)后不良的特點。另1例HCM患兒攜帶有MYH7的雙突變，她是本研究HCM病例中唯一一例死亡的患者，該患兒10歲時就有胸痛、心衰等表現(xiàn)，12歲因心力衰竭死亡，其姐姐在4歲因HCM猝死，支持文獻(xiàn)報道的該類病例具有病情重、預(yù)后差的特點。因此，對于檢測到一個基因上雙突變位點的病例，應(yīng)密切隨訪，并早期告知家屬其預(yù)后情況。HCM中，TNNT2的突變位點R92Q，R92W，R130C等引起的心肌肥厚不嚴(yán)重，但易引發(fā)心源性猝死［14］。本研究中檢測到的TNNT2?R130C的突變的患兒心肌肥厚亦不嚴(yán)重，其母親未攜帶此突變，父親已于30歲猝死，高度懷疑其猝死與此突變相關(guān)，該患兒目前無臨床癥狀，但根據(jù)其基因型與家族猝死史，臨床應(yīng)予以密切關(guān)注，加強(qiáng)隨訪，必要時應(yīng)早期應(yīng)用置入性心臟除顫器預(yù)防猝死。MILANO等［15］曾發(fā)現(xiàn)HCN4?G482R突變的LVNC患者常合并有竇性心動過緩，本研究中有1例LVNC患兒也檢測到了HCN4?G482R突變，該患兒同樣具有顯著的心動過緩，而本文中其他LVNC病例均不合并明顯的竇性心動過緩。

由于受到研究經(jīng)費、研究時間等方面的限制，本研究尚有一些突變位點目前未能明確是否致病，突變位點與臨床表型的關(guān)系也未得到大樣本的驗證。今后，將對研究病例進(jìn)行長期隨訪、擴(kuò)大樣本量，以上述問題進(jìn)行深入研究。

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