ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法對蜂蜜中金剛烷胺和金剛乙胺藥物殘留的測定

龔波 金秀娥 李菁菁 吳曉翠 王峻

摘要：建立了快速測定蜂蜜中金剛烷胺和金剛乙胺藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。樣品用1%甲酸乙腈提取，濃縮后利用超高效液相色譜分離，以乙腈和0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，MRM反應監測模式檢測。結果表明，在0.1～100 μg/L的系列濃度范圍內均呈良好線性關系，相關系數大于0.999。金剛烷胺檢測限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，金剛乙胺檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。在1～20 μg/kg濃度范圍內平均回收率為80%～110%，精密度小于20%。該方法方便快捷、定性準確，適用于蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺藥物殘留檢測。

關鍵詞：蜂蜜;金剛烷胺;金剛乙胺;殘留;超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類號：S859.84? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0136-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.037? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： A UPLC-MS/MS method was developed and established to raplidly determine amantadine and rimantadine in honey. The sample were extracted with acetonitrile with 1% formic acid. After enrichment，the sample was separated by UPLC，eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 0.1～100 μg/L， and the correlation coefficient were more than 0.999. The detection limit of the amantadine was 0.2 μg/kg， and the limit of quantification was 0.5 μg/kg;the detection limit of the rimantadine was 0.5 μg/kg， and the limit of quantification was 1.0 μg/kg. The average recoveries were 75%～110% in the range from 1～20 μg/kg，and the precision was less than 20%. The method was convenient， rapid， accurate and it was suitable for the detection of amantadine and rimantadine in honey.

Key words： honey; amantadine; rimantadine; residues; UPLC-MS/MS

蜂蜜是一種被廣泛認知的天然營養食品，富含果糖、葡萄糖、酶、蛋白質、維生素及多種礦物質，具有滋養、潤燥、解毒等功效，是中醫常用的中藥材之一。現代醫學研究表明，蜂蜜對肝臟、心臟、高血壓以及胃腸道方面的疾病都有治療和預防的作用[1]。因此，蜂蜜作為藥食同源的營養品，被人們廣泛應用。但在蜂養殖業中，蜂農為了防止蜂病發生而造成損失，往往會給蜜蜂飼喂抗生素等藥物，導致蜂蜜中藥物殘留的情況愈發嚴重。2017年，在對湖北部分地區的蜂農走訪調查中發現，有蜂農給蜂群飼喂含金剛烷胺、金剛乙胺等成分的藥物時有發生。

金剛烷胺（Amantadine，ATD）是飽和三環癸胺的氨基衍生物，是首個被FDA批準的抗流感病毒藥物。金剛乙胺是將金剛烷胺的氨基用乙胺基代替得到的藥物，該藥物作為抗病毒藥于1993年被美國批準用于A型流感病毒的預防和治療作用[2]。但該類藥物作用于動物疾病并沒有相關數據支持和科學根據。2005年12月，中國農業部發布《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規定列入《獸藥地方標準廢止目錄》（農業部公告第560號）的金剛烷胺、金剛乙胺等及其鹽、酯的單、復方制劑停止生產、經營、使用[3]。目前，金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥物殘留檢測方法的報道主要集中在血漿和尿液等生物體液、畜禽產品、飼料以及獸藥中的非法添加領域[4-6]，王彩娟等[7]研究了蜂蜜中嗎啉胍藥物殘留檢測，而蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥物殘留檢測方法研究目前仍是空缺。本研究以蜂蜜為基質，研究了金剛烷胺、金剛乙胺兩種抗病毒藥物殘留檢測方法，前處理快速簡單，靈敏度高，為該藥物的殘留情況進行檢測和排查提供了科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

島津8050液相質譜串聯儀;冷凍高速離心機;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;渦旋混合器;振蕩器;氮吹儀。金剛烷胺（Amantadine，ATD）、金剛乙胺（rimantadine，RTD）與金剛烷胺內標D6均來自于ChromaDex公司;甲醇、乙腈（色譜純，Tedi）;甲酸（色譜純，J.T.Baker，88%）;去離子水（Milli-Q，電阻率18.2 MΩ·cm）;高純氮、高純氬（純度均為99.999%）。

1.2? 標準溶液配制

混合標準儲備液：分別精密稱取金剛烷胺、金剛乙胺對照品約10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的混合標準儲備液。

混合標準中間液：量取混合標準儲備液100 μL置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 ng/mL的混合標準中間液。

內標儲備液：精密稱取金剛烷胺內標D6對照品約10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的內標儲備液。

內標中間液：量取內標儲備液100 μL置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 ng/mL的內標中間液。

1.3? 樣品處理

稱取蜂蜜2±0.02 g，置于50 mL塑料離心管內，加適量金剛烷胺內標溶液，加1%甲酸乙腈6 mL，渦旋1 min后加入2 g無水硫酸鈉，渦旋振勻，振蕩提取10 min。10 000 r/min離心5 min，取上層清液50 ℃氮氣吹干。加入乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶9）1.0 mL充分渦旋溶解，過0.2 μm濾膜后上機待測。

2? UPLC-MS/MS條件

2.1? 超高效液相色譜條件

色譜柱：Xbridge C18（5 μm，2.1 mm×150 mm）;流動相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈，梯度洗脫：0～2.0 min，10%B，2.0～5.0 min，10%B～90%B，6.0～6.1 min，90%B～10%B，6.1～8.0 min，10%B流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;柱溫35 ℃。

2.2? 質譜條件

電噴霧離子源ESI（+）;接口溫度（Interface temperature）350 ℃;DL溫度（DL temperature）250 ℃;加熱塊溫度（heatblock temperature）400 ℃;霧化氣流速：3.0 L/min;干燥氣流速：10.0 L/min;加熱氣流速：10.0 L/min;多反應監測（MRM采集模式）。各種藥物的定性離子對、定量離子對和質譜參數見表1。

2.3? 標準曲線、檢出限、定量限

精密量取一定量的混合標準中間液，加入適量內標溶液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶9）分別配成濃0.1、0.5、2、10、20、100 μg/L的系列基質混合標準工作溶液，使用時現用現配。每個濃度重復3次測定。以分析物與內標物峰面積之比（Y）和分析物與內標物質量濃度之比（X）作線性回歸分析，得到回歸方程和相關系數（表2）。結果表明，金剛烷胺、金剛乙胺質量濃度在0.1～100 μg/L范圍內呈現良好線性關系。采用基質中添加目標化合物的方法，經試驗得到特征離子色譜峰信噪比，信噪比≥3的最低濃度即方法的檢出限（LOD），信噪比≥10的最低濃度為即方法的定量限（LOQ），其結果見表2。空白基質中添加各藥物后得到的特征離子質量色譜如圖1、圖2所示。

2.4? 回收率和精密度

選取空白的蜂蜜樣品作為添加回收試驗基質，分別進行1、5、20 μg/kg 3個不同濃度的加標試驗，每個濃度做6組平行，重復進行3次，結果見表3。在不同加標濃度下，金剛烷胺、金剛乙胺的回收率為80.1%～109.7%，批內RSD≤10%，批間RSD≤10%，能滿足目標藥物殘留的檢測要求。

3? 小結與討論

3.1? 前處理條件的選擇

為了取得更好的萃取效果，比較了乙腈和甲醇2種提取液，發現用乙腈提取的目標物回收率要高于用甲醇提取的回收率。金剛烷胺和金剛乙胺結構中都含有氨基，并且極性較強，采用含酸的有機溶劑更有利于提取[8]，因此采用1%甲酸乙腈作為提取液。

比較了MCX固相萃取法、分散固相萃取法以及直接提取法，發現使用MCX固相萃取法、分散固相萃取法時，2種目標物均有較好的提取凈化效果;1%甲酸乙腈直接提取法雖然在氮吹濃縮的同時增加了基質效應，但加入內標校正后，基質效應消除，定性、定量分析均能滿足試驗要求。相比其他2種萃取法，直接提取法更經濟并且簡單快捷，故本研究采用直接提取法，并加入內標校正。

3.2? 質譜及色譜條件優化

金剛烷胺和金剛乙胺結構中均含有-NH2，易形成〔M+H〕+的準分子離子，適合在ESI+模式下掃描，優化后確定目標物的離子對、碰撞能力以及霧化氣壓力、干燥器溫度等質譜分析參數。

采用了乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液等幾種不同的流動相進行色譜分離試驗，發現當流動相中含有乙酸銨時對目標物的響應有抑制作用，乙腈-水作為流動相時，目標物峰型較差。當乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，兩種化合物的峰型和響應都能滿足要求。

3.3? 基質效應

通過以甲醇配制標準工作曲線和用陰性基質液配制的標準工作曲線，結果發現，2種藥物均存在不同程度的基質抑制效應。為了減少基質效應對化合物定量的影響，可以加入內標同位素來定量計算。當基質曲線斜率與標準曲線斜率之比在85%～115%之間不存在明顯的基質效應，而經過內標校正后的基質曲線與標準曲邊斜率之商符合要求，因此采用內標校正，用甲醇直接配制標準曲線。

3.4? 小結

通過對樣品前處理條件和質譜、色譜條件進行優化，建立了蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺殘留檢測的UPLC-MS/MS分析方法。該方法操作簡單，檢測成本較低，準確度和靈敏度均能滿足獸藥殘留分析要，可用于實際樣品檢測。

參考文獻：

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[4] 陳慧華，韋敏玨，周? 煒，等.液相色譜-串聯質譜法測定動物組織中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量[J].質譜學報，2013，34（4）：227-232.

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[7] 王彩娟，祝偉霞，楊冀州，等.蜂蜜中嗎啉胍殘留的液相色譜-串聯質譜分析方法研究[A].中國化學會色譜專業委員會，北京色譜學會.全國生物醫藥色譜及相關技術學術交流會論文集[C].貴陽：2012.

[8] 云? 環，崔鳳云，嚴? 華，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J].色譜，2013，（8）：724-728.