周至縣獼猴桃根結(jié)線蟲種類鑒定

劉晨+王晨光+張鋒+陳志杰+李英梅+張淑蓮

摘要 通過形態(tài)學(xué)鑒定方法及PCR鑒定方法對周至縣獼猴桃根部采集的根結(jié)線蟲進(jìn)行了種類鑒定。結(jié)果表明，感染周至縣獼猴桃的病原線蟲種類為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。

關(guān)鍵詞 獼猴桃；根結(jié)線蟲；種類鑒定；陜西周至

中圖分類號 S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0117-02

Identification of Root-knot Nematode on Actinidia chinensis in Zhouzhi County

LIU Chen 1 WANG Chen-guang 2 ZHANG Feng 1 CHEN Zhi-jie 1 LI Ying-mei 1 ZHANG Shu-lian 1 *

（1 Bio-Agriculture Institute of Shaanxi，Xi′an Shaanxi 710043； 2 Agriculture Department of Shaanxi Province）

Abstract We used morphological and PCR identification methods to determine the species of root-knot nematodes which occurred on the root of Actinidia chinensis.The samples were collected from Zhouzhi County of Shaanxi Province.The results demonstrated that all samples of root-knot nematode belonged to Meloidogyne incognita.

Key words Actinidia chinensis；root-knot nematode；species identification；Zhouzhi Shaanxi

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是植物寄生線蟲的重要類群，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，其寄主范圍廣，常造成作物大面積減產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[1-3]。獼猴桃原產(chǎn)于中國，具有“水果之王”“保健水果”的美譽(yù)[4]。周至縣是世界公認(rèn)的獼猴桃原生區(qū)，并以其得天獨厚的氣候、地理優(yōu)勢成為我國獼猴桃的最佳適生區(qū)[5]，是聞名全國的“獼猴桃之鄉(xiāng)”。2016年，周至縣獼猴桃集中連片種植面積已達(dá)2.73萬hm2，占全國面積的25%、全球面積的18%，年產(chǎn)鮮果49萬t，占全國產(chǎn)量的40%、全球產(chǎn)量的15%，獼猴桃已成為周至縣的立縣產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收致富的重要產(chǎn)業(yè)。隨著獼猴桃種植面積的不斷擴(kuò)大，獼猴桃根結(jié)線蟲病發(fā)生越來越重，嚴(yán)重影響獼猴桃的產(chǎn)量。本文通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定[6]，確定感染周至縣獼猴桃的根結(jié)線蟲種類，從而為果農(nóng)做好獼猴桃根結(jié)線蟲的防治工作提供理論依據(jù)，為促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在周至縣采集感染根結(jié)線蟲的獼猴桃病根。取樣采用分區(qū)隨機(jī)取樣法，共采集8個樣點，樣品保存在4 ℃ 冰箱備用。

1.2 形態(tài)鑒定

將病根洗凈后放入蒸餾水中，挑取雌成蟲放入滴有45%乳酸的載玻片上，在顯微鏡下用解剖刀從蟲體后部約1/4處輕輕切下。將后部中雜物用針尖輕輕清除干凈，使切口向下將后部展開，做成臨時裝片[7-8]。

1.3 根結(jié)線蟲PCR電泳檢測

用康為世紀(jì)公司的基因組DNA提取試劑盒對單頭及混合種群的根結(jié)線蟲進(jìn)行DNA提取，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，設(shè)計4對不同引物，見表1。

PCR反應(yīng)體系：25 μL Premix Taq、5 μL DNA模板、上游和下游引物各2 μL、16 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 復(fù)性30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL于1% 瓊脂糖凝膠（含EB替代物）電泳檢測，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

對采自周至縣獼猴桃病根中的根結(jié)線蟲，隨機(jī)挑選20頭雌成蟲進(jìn)行形態(tài)特征觀測。由圖1可以看出，其會陰花紋線緊密，呈波浪形、橢圓形或近圓形，無明顯側(cè)線，背弓較高，背弓頂部圓或平。觀察到根結(jié)線蟲特征與劉維志[10]描述一致，可以確認(rèn)供試根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

2.2 PCR電泳檢測結(jié)果

所用的4對根結(jié)線蟲特異性引物，只有南方根結(jié)線蟲的特異性引物從供試樣品中擴(kuò)增出了條帶，如圖2所示。結(jié)果表明，感染獼猴桃根結(jié)的為南方根結(jié)線蟲。

3 結(jié)論與討論

根結(jié)線蟲是世界性防治難題，全世界報道的根結(jié)線蟲逾80種，中國報道的有58種[10-11]，其中南方根結(jié)線蟲發(fā)生面積最大且為害的蔬菜種類最多，是當(dāng)今世界上最具破壞性的病原物之一[12]。有研究表明，陜西省20多個縣區(qū)不同蔬菜根系根結(jié)線蟲中南方根結(jié)線蟲占采集點的97.2%，是保護(hù)地蔬菜的絕對優(yōu)勢種群[13]，且發(fā)生范圍逐年擴(kuò)大，危害不斷加重。根結(jié)線蟲作為獼猴桃生產(chǎn)中的一種災(zāi)害，其發(fā)生面積和危害程度有逐年擴(kuò)大和加重的趨勢，易造成樹勢衰弱、抗逆性降低，加劇了獼猴桃潰瘍病的發(fā)生。明確獼猴桃根結(jié)線蟲的種類，對建立獼猴桃根結(jié)線蟲綜合防治技術(shù)體系以及促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

根結(jié)線蟲種類鑒定通常采用形態(tài)學(xué)鑒定，即在顯微鏡下觀察雌成蟲會陰花紋的特征并做出正確的鑒定。但同一種群間由于寄主和環(huán)境條件的差異，形態(tài)上也會有所變化[14]，給準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲種類帶來干擾。隨著分子生物學(xué)試驗方法的不斷發(fā)展，通過酯酶同工酶電泳法[15]及PCR方法可以從DNA水平上對根結(jié)線蟲種類的鑒定提供更準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。本研究主要通過對采集的獼猴桃根結(jié)線蟲進(jìn)行雌成蟲會陰花紋觀察，同時結(jié)合PCR方法鑒定，首次確定了周至縣獼猴桃根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita），可為防治根結(jié)線蟲提供理論依據(jù)，為建立獼猴桃根結(jié)線蟲綜合防治技術(shù)體系提供借鑒，為保證獼猴桃產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展提供保障。但有關(guān)獼猴桃上南方根結(jié)線蟲與蔬菜上南方根結(jié)線蟲的同源性有待進(jìn)一步研究。endprint

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