文冠果果殼醇提物不同部位總多酚含量及其抗氧化活性研究

李國倩 秦天 黃蓉 唐祥 楊春艷 周春陽

[摘要] 目的 建立文冠果果殼醇提物總多酚含量（TPC）測定方法，并評價文冠果果殼醇提物不同部位總多酚含量和體外抗氧化活性。 方法 采用分光光度法測定文冠果果殼總多酚的含量；采用ABTS和DPPH自由基評價文冠果果殼多酚的抗氧化活性。 結果 文冠果果殼總多酚含量為10.22 mg/g。D101大孔樹脂純化后，多酚主要集中在30%乙醇洗脫部位（4.92 mg/g）。該部位ABTS和DPPH自由基的IC50值分別為（4.83±0.33）、（9.33±0.23）μg/mL；陽性對照蘆丁對ABTS和DPPH自由基的IC50值為（12.87±0.21）、（10.29±0.17）μg/mL。 結論 文冠果果殼醇提物大孔樹脂30%乙醇洗脫部位的總多酚含量最高，抗氧化活性最強，值得進一步開發利用。

[關鍵詞] 文冠果；總多酚含量；正交試驗；抗氧化活性

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0027-06

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）又名木瓜、文登閣、僧燈毛道，隸屬于無患子科文冠果屬（Xanthoceras）植物，一屬一種，灌木或喬木，分布于我國甘肅、遼寧、河北、陜西等省。文冠果為我國北方特有的木本油料作物，有“北方油茶”之稱，具有較高的經濟價值和藥用價值[1]。文冠木（文冠果的干燥心材）曾列入《中華人民共和國藥典》（1977年版），主要用于治療類風濕性關節炎、風濕內熱和皮膚風熱等癥[2]。

文冠果果殼是一種農業廢物，主要含有多酚[3]和皂苷[4]類成分，具有改善學習記憶功能、抗癌、抑制酪氨酸酶、治療心腦血管疾病、抗氧化、抗炎和抑制胰脂肪酶活性等多種生物活性[5-7]。目前，文冠果果殼總多酚的含量[8]、抗氧化活性的相關研究鮮見報道。因此，本研究采用單因素實驗和正交實驗[9]確定文冠果果殼總多酚含量測定的最佳顯色條件；采用該顯色條件評價文冠果果殼醇提物經D101大孔樹脂純化前后不同部位的總多酚含量；采用ABTS和DPPH自由基評價文冠果果殼醇提物不同部位的抗氧化活性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1750型紫外分光光度計（日本島津公司）；FA2004分析電子天平（0.0001 g，上海良平儀器儀表有限公司）；KQ-300DE型臺式數控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；HH-9數顯恒溫水浴鍋（金壇市國旺實驗儀器廠）。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：20120227，HPLC≥98%，成都市科龍化工試劑廠）；蘆丁（批號：MUST-16111111，HPLC≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；DPPH（批號：034K1071，HPLC≥98%，Sigma）；ABTS（201406，HPLC≥98%，Aladdin）；水為自制超純水，鎢酸鈉（批號：20161 227，上海中秦化學試劑有限公司）、鉬酸鈉（批號：201 41119，天津市化學試劑四廠）、硫酸鋰（批號：20160 409，天津市巴斯夫化工有限公司）等試劑均為分析純。

文冠果果殼采自甘肅省白銀市，經中國科學院蘭州化學物理研究所戚歡陽副研究員鑒定為無患子科文冠果屬植物文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）的果殼。

2 方法與結果

2.1 總多酚含量分析

2.1.1 對照品溶液的制備 準確稱取10.0 mg干燥的沒食子酸，加蒸餾水適量，超聲溶解，放冷，以蒸餾水定容至100 mL，制成每毫升含0.1 mg沒食子酸的溶液，即為對照品溶液，4℃冰箱保存備用。

2.1.2 福林試劑的配制 參照文獻[10]配制，貯于棕色瓶中，4℃冰箱保存備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取文冠果果殼粉300.1 g，70%乙醇（料液比為1∶10），60℃超聲提取3次（每次60 min），得文冠果果殼醇提物（XST）53.3 g，4℃冰箱保存備用。取該文冠果果殼醇提物48.3 g進行D101大孔吸附樹脂柱層析，分別采用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇依次進行洗脫，得到水部位（XSW）37.2 g，30%乙醇洗脫部位（XS30%E）3.2 g，50%乙醇洗脫部位（XS50%E）4.4 g，70%乙醇洗脫部位（XS70%E）2.9 g，95%乙醇洗脫部位（XS95%E）0.8 g。各部位4℃冰箱保存備用。精密稱取XST、XSW、XS30%E、XS50%E、XS70%E和XS95%E各0.14 g，加超純水溶解并定容至100 mL，抽濾后備用。

2.1.4 檢測波長 取按“2.1.1”配制的對照品溶液適量，稀釋5倍，精密吸取該對照品溶液和所配供試品溶液各0.2 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加入1 mL超純水，搖勻，加入福林試劑0.5 mL，搖勻，放置1 min；加入10%碳酸鈉溶液1 mL，加水稀釋至刻度，充分搖勻后置于60℃的恒溫水浴鍋中反應60 min，以超純水為空白，于550～850 nm下掃描，記錄紫外光譜圖。

文冠果果殼多酚提取溶液和沒食子酸對照品溶液與Folin-Ciocalteu試劑反應后分別在波長762、764 nm處有穩定的最大吸收峰（圖1），故確定檢測波長為762 nm。

2.1.5 線性關系的考察 取按“2.1.1”配制的對照品溶液適量，稀釋5倍，精密吸取該對照品溶液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL，按照“2.1.4”方法，于762 nm 波長處測定各吸光度值（A）。以A值為縱坐標，對照品溶液濃度C為橫坐標作圖，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=0.1298X+0.0583（R2=0.9981）。沒食子酸濃度在1.2～5.0 mg/L范圍內與其吸光值呈現良好的線性關系。標準曲線見圖2。

2.1.6 單因素試驗 分別精密量取供試品溶液0.2 mL，按“2.1.4”項下方法顯色，采用單因素優化法分別對體系中顯色時間（20、40、60、80、100、120 min）、顯色溫度（30、40、50、60、70、80、90℃）、福林試劑用量（0.25、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mL）、10%碳酸鈉溶液用量（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL）對總多酚含量測定的影響進行考察（以上實驗均平行測定3次）。

從圖3A可以看出，反應80 min后，文冠果果殼醇提物吸光度值變化不明顯。因此，確定最佳顯色時間為80 min。反應溫度超過70℃后，吸光值逐漸降低（圖3B），提示多酚類化合物在高溫下不穩定。因此，確定最佳的顯色溫度為70℃。當Folin-Ciocalteu試劑用量為0.5 mL時，吸光度值達到最大值（圖3C）。因此，確定Folin-Ciocalteu試劑的最佳用量為0.5 mL。文冠果果殼醇提物的吸光值隨碳酸鈉溶液加入量的增加而升高，但當加入量>1.0 mL時，吸光度值逐漸降低，故確定10%碳酸鈉溶液的最佳加入量為1.0 mL（圖3D）。

2.1.7 正交實驗 在單因素實驗的基礎上選取顯色時間、顯色溫度、福林試劑用量、10%碳酸鈉用量，測定文冠果果殼醇提物中總多酚的含量，以優化文冠果果殼醇提物多酚類化合物的最佳提取工藝。設計正交實驗，見表1。

根據正交試驗結果，文冠果果殼總多酚含量測定的最佳顯色條件為：顯色溫度60℃，顯色時間100 min，FC試劑用量0.6 mL，10%碳酸鈉溶液用量0.75 mL。見表2～3。

2.1.8 穩定性試驗 分別取同一供試品溶液0.2 mL，按照文冠果果殼總多酚含量測定的最佳條件，顯色后室溫下放置，于15、30、45、60、90、120 min測定吸光度，并計算總多酚含量，顯色后2 h內的吸光度RSD為0.09%。提示供試品溶液在室溫下2 h內穩定。

2.1.9 精密度試驗 分別準確吸取同一供試品溶液0.2 mL，共5份，分別置5 mL容量瓶，按文冠果果殼總多酚含量測定的最佳條件，測定吸光度，并計算總多酚含量，RSD為0.04%，提示儀器精密度良好。

2.1.10 重復性試驗 分別精密稱取文冠果果殼粉末0.5 g左右，按照供試品溶液的制備方法，平行制備5份供試品溶液。取供試品溶液0.2 mL，按文冠果果殼總多酚含量測定的最佳條件，測定吸光度，計算文冠果果殼總多酚平均含量為10.22 mg/g，RSD為0.85%，提示該方法重復性較好。

2.1.11 回收率試驗 分別精密稱取文冠果果殼粉末6份，每份0.5 g左右，各加入精密稱取的10 mg左右的沒食子酸對照品，再按“2.13”制備供試品溶液，測定沒食子酸含量，計算回收率，RSD為1.04%。見表4。

2.1.12 含量測定 樣品按“2.1.3”項制備供試品溶液，并按正交實驗所得最佳含量測定方法測定總多酚含量。

文冠果果殼70%乙醇提取物通過D101大孔吸附樹脂純化后，其總多酚主要集中在30%乙醇洗脫部位和50%乙醇洗脫部位，尤其是30%乙醇洗脫部位。見表5。

2.2 抗氧化活性測定

文冠果果殼各提取部位對ABTS和DPPH自由基的捕獲活性通過采用文獻[11]上的方法進行測量。

以蘆丁為陽性對照，蘆丁、XST、XS30%E和XS50%E在100 μg/mL時具有較強的抗氧化活性；隨后進行了這些部位的IC50測試，顯示陽性對照蘆丁對ABTS+和DPPH自由基的半數捕獲濃度分別為（12.87±0.21）、（10.29±0.17）μg/mL；XST、XS30%E和XS50%E對ABTS+自由基的半數捕獲濃度分別為（104.8±0.07）、（4.83±0.33）、（15.42±0.17）μg/mL；XS30%E和XS50%E對DPPH自由基的半數捕獲濃度分別為（9.33±0.23）、（32.11±0.16）μg/mL。見圖4。

3 討論

福林酚法檢測多酚含量簡便易行，顯色靈敏、范圍寬且穩定，具有較好的精密度、準確度和特異性[12-13]。多酚主要包括黃酮、酚酸和其他的多酚（包括芪類和木質素），其結構特征是至少有一個芳香環，而且芳香環上有一個或多個羥基[14]。多酚類物質最重要的功能是抗氧化和清除自由基[15]，對心血管類、糖尿病等疾病，如動脈粥樣硬化[16-18]、心絞痛[19]、腦梗死[20]、心肺衰竭[21]、糖尿病腎病[22]等具有良好的療效。該功能與多酚的結構有關，酚羥基可提供活潑氫使自由基滅活，本身被氧化形成含有鄰二酚結構的自由基而具有較高的穩定性[23]。本研究采用ABTS、DPPH評價總多酚的抗氧化活性，其操作簡便、結果準確、響應靈敏；缺點是該方法是一種體外檢測方法，對于真實的生理環境只能盡可能接近，卻無法真正模擬，故一般抗氧化研究都會選取兩種以上的方法來共同說明某物質的抗氧化能力[24-25]。

本研究表明，文冠果果殼醇提物通過D101大孔吸附樹脂純化后，30%乙醇洗脫部位的抗氧化活性最強，比陽性藥蘆丁的抗氧化活性還強，提示抗氧化活性成分主要集中在30%乙醇洗脫部位。此外，本研究表明D101大孔吸附樹脂對文冠果果殼中的多酚類抗氧化劑具有較好的分離富集效果。既往研究[11]顯示，文冠果果殼中的多酚類主要包括表兒茶素、槲皮苷、蘆丁、楊梅素-3-O-β-D蕓香糖苷、槲皮素、原兒茶酸、兒茶素等。由此推測，30%乙醇洗脫部位強大的抗氧化能力有可能是多種多酚類抗氧化劑協同作用的結果。

氧化應激在多種疾病的發生發展中起著重要的作用[26-27]，是動脈粥樣硬化的重要發病機制[28-30]。因此，本研究為文冠果果殼在保健食品，尤其是藥品領域中的進一步開發利用提供參考依據。

[參考文獻]

[1] Zhao L，Li X，Ye ZQ，et al. Nutshell extracts of Xanthoceras sorbifolia：a new potential source of bioactive phenolic compounds as a natural antioxidant and immunomodulator [J]. J Agri Food Chem，2018，66（15）：3783-3792.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：化學工業出版社，1977：121-122.

[3] Li N，Wang Y，Li X，et al. Bioactive phenols as potential neuroinflammation inhibitors from the leaves of Xanthoceras sorbifolia Bunge [J]. Bioorg Med Chem Lett，2016， 26（20）：5018-5023.

[4] Wang D，Yu B，Chen C，et al. New natural barrigenol-like triterpenoid isolated from the husks of Xanthoceras sorbifolia Bunge [J]. Nat Prod Res，2018，32（9）：997-1003.

[5] 楊春艷，楊軍麗，哈偉，等.文冠果果殼化學成分與生物活性研究進展[J].中草藥，2016，47（8）：1418-1424.

[6] Ji XF，Chi TY，Liu P，et al. The total triterpenoid saponins of Xanthoceras sorbifolia improve learning and memory impairments through against oxidative stress and synaptic damage [J]. Phytomedicine，2017，25：15-24.

[7] Jiao Q，Zou L，Liu P，et al. Xanthoceraside induces apoptosis in melanoma cells through the activation of caspases and the suppression of the IGF-1R/Raf/MEK/ERK signaling pathway [J]. J Med Food，2014，17（10）：1070-1078.

[8] 李媛，施歡賢.文冠果殼總多酚的含量測定[J].中國民族民間醫藥，2017，26（16）：13-14.

[9] 曾濤，宋國際.“正交設計助手”軟件在銀鏡反應實驗中的應用[J].化學教學，2005，5：50-51，46.

[10] 周媛，喻玲玲，李新蘭，等.苧麻葉中總多酚的含量測定[J].食品科技，2009，34（4）：193-197.

[11] Yang CY，Ha W，Lin Y，et al. Polyphenols isolated from Xanthoceras sorbifolia husks and their anti-tumor and radical-scavenging activities [J]. Molecules，2016，21（12）：1694.

[12] 彭茹潔，汪佳丹，韓偉.植物多酚提取、分離純化及其分析方法的研究進展[J].制藥裝備，2016，22（5）：21-29.

[13] 王毓寧，李鵬霞，胡花麗，等.Folin-酚法測定水蜜桃果酒中總多酚[J].釀酒，2012，39（5）：60-62.

[14] Cheng YC，Sheen JM，Hu WL，et al. Polyphenols and oxidative stress in atherosclerosis-related ischemic heart disease and stroke [J]. Oxid Med Cell Longev，2017，2017（5）：8 526 438.

[15] 尹文清，宋鑫明，陳光英，等，青梅葉中多酚含量測定及抗氧化活性研究[J].食品科技，2009，34（5）：283-286.

[16] 林楊闖，余祖善.丹參多酚酸鹽輔助治療對急性冠脈綜合征患者血管內皮功能的影響及療效觀察[J].中國現代醫生，2017，55（5）：26-28.

[17] 陳麗華.丹參多酚酸鹽治療急性腦缺血的臨床研究[J].中外醫學研究，2017，15（13）：114-116.

[18] 唐曦，茍博，劉洪，等.綠茶多酚對家兔動脈粥樣硬化抑制作用的實驗研究[J].西部醫學，2016，28（2）：177-180.

[19] 吳源鴻，黃抒偉，林冬銘，等.丹參多酚酸鹽對不穩定型心絞痛患者PCI圍術期的療效分析[J].中國現代醫生，2016，54（21）：99-103.

[20] 何國銳.丹參多酚酸配合常規治療急性腦梗死的可行性分析[J].中國當代醫藥，2018，25（7）：63-65.

[21] 劉本洪，周寧，孫明祥，等.無創通氣聯合丹參多酚酸鹽對肺心病呼吸衰竭患者血液流變學指標的影響[J].成都醫學院學報，2016，11（2）：229-231.

[22] 陳軍，周海舟，王育林，等.丹參多酚酸鹽聯合氯沙坦鉀對老年糖尿病腎病相關因素的影響[J].西部醫學，2018，30（10）：1451-1455，1461.

[23] 陳繼英，郭嘉林，張存彥，等.茶多酚的研究進展[J].中草藥，2004，35（10）：11-13.

[24] Bernini R，Barontini M，Cis V，et al. Synthesis and evaluation of the antioxidant activity of lipophilic phenethyl trifluoroacetate esters by in vitro ABTS，DPPH and in cell-culture DCF assays [J]. Molecules，2018，23（1）：208.

[25] 周海玲，馬麟，易智彪.基于三種體外抗氧化方法對白木香種子抗氧化能力的研究[J].中國醫藥導報，2016， 13（22）：12-15.

[26] Ren C，Hu X，Zhou Q. Graphene oxide quantum dots reduce oxidative stress and inhibit neurotoxicity in vitro and in vivo through catalase-like activity and metabolic regulation [J]. Adv Sci，2018，5（5）：1 700 595.

[27] Yang L，Xian D，Xiong X，et al. Proanthocyanidins against oxidative stress：from molecular mechanisms to clinical applications [J]. Biomed Res Int，2018，2018（1）：1-11.

[28] Asha K，Singal A，Sharma SB，et al. Dyslipidaemia & oxidative stress in patients of psoriasis：Emerging cardiovascular risk factors [J]. Indian J Med Res，2017，146（6）：708-713.

[29] Chmielowski RA，Abdelhamid DS，Faig JJ，et al. Athero-inflammatory nanotherapeutics：ferulic acid-based poly （anhydride-ester） nanoparticles attenuate foam cell formation by regulating macrophage lipogenesis and reactive oxygen species eneration [J]. Acta Biomate，2017， 57：85.

[30] 李丹云，王賀，司春嬰，等.支架內新生動脈粥樣硬化的病理機制及其防治的中西醫研究進展[J].中國醫藥導報，2017，14（22）：47-50.

（收稿日期：2018-05-14 本文編輯：王 蕾）