IVC獨立送風系統在裸鼠繁育中的應用及其效果分析*

劉勇 趙龍 張凡 柏合

【摘要】 目的：探究在裸鼠繁育中應用IVC獨立送風系統的效果。方法：自2016年6月從本校醫藥研究中心SPF級動物室中，選擇一間約20 m2的房間，在無特殊病原微生物（SPF）屏障系統的基礎上安裝IVC獨立送風系統，作為研究組；另選擇相同大小的房間，僅安裝SPF屏障系統，作為對照組。研究起始，對照組與研究組都放置6只雌鼠（nu/+）與6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合籠。截止到2017年12月，統計兩組的分娩間隔、平均每胎產仔數、存活率。結果：兩組的分娩間隔、平均每胎產仔數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；研究組的存活率顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：在裸鼠的繁育過程中應用IVC獨立送風系統，能夠顯著提升裸鼠的存活率，從而能為臨床動物實驗提供更多優質可用的實驗動物。

【關鍵詞】 裸鼠； SPF屏障系統； IVC獨立送風系統； 分娩間隔； 存活率

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.007

作為一種存在先天性免疫缺陷的實驗動物，裸鼠的免疫力低下是由于T細胞的缺失所造成的。裸鼠需要在無特殊病原微生物（specific pathogen free，SPF）級以上的環境中生長。管理中稍有不慎就會導致種群的死亡與污染[1]。正因為如此，裸鼠的繁育飼養成為困擾研究人員的重大問題。裸鼠最重要的三個特征是無毛（hairless）、無胸腺（athymus）和裸體（Naked）。原種的裸鼠表現出無鼻毛的特征，足尖常常處于收縮的狀態、螺旋樣畸形。性成熟的雌性裸鼠沒有規律的發情周期，卵巢比較小，注射hCG后無法促進其排卵。除了雌性裸鼠在生殖方面有缺陷外，雄性裸鼠經常產生畸形的精子，活動力低下，因此原種裸鼠的生育力極低[2]。新生的裸鼠剛開始的生長速度和正常小鼠沒有明顯差異，但在3周后，約是離乳的時間，裸鼠的生長速度顯著遲緩，普遍表現出肝臟疾病，死亡率較高，平均壽命在14～25周。經過優化育種后的遠交系無胸腺裸體小鼠在外形上看，與原種一致，全身接近于無毛，有時可在裸鼠的背部見到稀疏的帶狀毛，皮薄、褶皺較多[3]。為提高裸鼠的存活率、純合裸鼠（nu/nu）的獲得率，本研究中心引入獨立送風系統（individual ventilated cages，IVC），探究獨立送風系統在裸鼠繁育中的應用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年6月本校醫藥研究中心從北京實驗動物研究所購入12只雌鼠（nu/+）、12只雄鼠（nu/nu），所選種鼠均為8周大。研究起始，對照組與研究組都放置6只雌鼠（nu/+）與6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合籠。

1.2 方法 從本校醫藥研究中心SPF級動物室中，選擇一間約20 m2的房間，在SPF屏障系統的基礎上安裝IVC獨立送風系統，作為研究組；另選擇相同大小的房間，僅安裝SPF屏障系統，作為對照組。

1.2.1 獨立送風系統的安裝與使用 研究組所使用的獨立送風系統購自蘇州市猴皇動物實驗設備科技有限公司，產品型號為MKS-112，廠家安排專業的工人上門安裝。裸鼠放置在配套使用的過濾帽鼠盒與層流柜。IVC獨立送風系統的良好運行，關鍵在于送、排風系統的設計與安裝。以國外先進設備為基礎，將動物福利考慮在內，IVC籠盒內的空氣流向應該使得過濾凈化后的空氣均勻平穩的分布在內，構成正壓風幕，避免過強氣流的產生。

1.2.2 裸鼠的飼養 （1）兩組室溫變化范圍控制在21～25 ℃。照明時間統一設定為光照12 h，黑暗12 h。空氣中的相對濕度控制30%～50%。（2）按照由低至高的不同級別設定空氣凈化與過濾裝置，三組空調交替完成過濾的任務[4]。（3）所用的生長繁殖飼料購買自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼料原料有豆渣、魚粉、啤酒酵母粉、植物油、玉米、小麥、麥麩、磷酸氫鈣、石粉、鐵、銅、錳、鋅、維生素A、維生素D、維生素E、維生素B1、泛酸等。最終飼料中各種營養物質的終濃度為：水分10%，粗蛋白23.59%，粗纖維2.1%，粗脂肪5.01%，粗灰分7.68%等。飼料買來之后，由于裸鼠過于低下的免疫力，需要對其進行放射的滅菌處理（Co60）。自由攝入，定期添補。每周可適量添加熟雞蛋黃、生瓜子[5]。（4）飲用水經過凈水器（四季沐歌MU-Q01凈水機）處理后，用鹽酸將pH值調至3.5左右，并在水中加入適量的濃縮魚肝油粉（武漢遠成共創科技有限公司生產）。自由攝入，定期添補。（5）每周更換一次墊料。

1.2.3 飼養注意事項 研究人員進入鼠房內，應穿著滅菌后的實驗服，并佩戴無菌口罩、帽子、乳膠手套。

1.2.4 飼養記錄 裸鼠到達研究中心時即建立表格，將籠號詳細的記錄清楚，便于后續統計數據。

1.3 觀察指標 每日上午9點至10點觀察裸鼠繁育情況。從每只雌鼠生下第一窩仔鼠開始記錄，截止到2017年12月底，統計兩組的分娩間隔、平均每胎產仔數，以及統計8周后的存活率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對照組的分娩間隔為（41.2±2.7）d，研究組為（43.7±2.8）d，兩組比較差異無統計學意義（t=1.986，P=0.064）。對照組平均每胎產（7.8±1.4）只，研究組平均每胎產（7.9±2.8）只，兩組比較差異無統計學意義（t=2.012，P=0.071）。仔鼠出生8周即性成熟后，對仍健在的新生裸鼠數進行統計分析，對照組的存活率為（76.9±3.4）%，顯著低于研究組的（86.4±1.7）%，差異有統計學意義（t=-6.122，P<0.001）。

3 討論

20世紀60年代，在英國的一家醫院里，一位醫生無意間在非近交系小鼠中發現幾只沒有毛發包被的小鼠。同年代，有學者證明了這種沒有毛發的小鼠的產生是由于染色體上的等位基因突變所造成的[6]。對這種小鼠的皮膚組織與正常小鼠的皮膚進行組織學分析，發現結構有異常，經證明是常染色體退化導致的，因此得名“裸體（Nude）”，“nu”是其突變的基因符號，可惜當時沒有引起大眾的注意[7]。此后，當研究人員發現裸鼠不具有胸腺，這才吸引了醫學與生物學相關的研究人員的關注。在裸鼠被發現之前，用動物模型去進行免疫學的研究，一般選擇的是給小鼠注射抑制T細胞的藥物，或者是手術摘除胸腺。由于藥物對T細胞的抑制作用不完全，手術的副作用過多，關于免疫學的研究進展處于一個緩慢前進的狀態。而裸鼠的發現，為免疫學的研究與進展提供了一個理想的實驗動物模型[8]。

因為裸鼠原種過于低下的免疫力，壽命短，生育率也較低，無法大規模的應用于實際的研究工作。目前在裸鼠的繁育過程中不用nu/nu雌鼠，因其繁殖性能低，一般采用雜合子交配方式或隱性純合子雄性與雜合子雌鼠交配。這種交配方法，其后代將出現表現型正常的仔鼠和裸鼠，比例為1︰1。為了改良這些缺點，人們將原種裸鼠與其他種群的小鼠雜交，一代代繁育，最終獲得了壽命較長、生育率好、免疫力能耐受SPF的遠交系無胸腺裸體小鼠，得以廣泛應用[9]。

因為沒有T細胞維持免疫力，繁育裸鼠所用的飼料、所處環境要求條件較為嚴格。國外的研究人員經過多年的繁育，得出了一定的經驗。裸鼠的繁育條件采用無特定病原體（SPF）級，飼養條件選定為屏障系統或隔離系統[10]。但是一些發生在裸鼠中的傳染性疾病也有所報道。各國根據自己的實際需要，在自身條件的基礎上建立了相應的質量控制方法，大力促進了裸鼠繁育工作和以裸鼠為實驗動物的其他相關學科的飛速發展[11]。

裸鼠的淋巴細胞與正常的淋巴細胞狀態不同，由于胸腺的異常，進而引發T細胞由無活性的狀態到有活性的轉變出現障礙[12]。雖然B細胞、T細胞的前體是正常的，由于胸腺不存在，因此無形成有功能的正常的T細胞[13]。因為不存在胸腺，裸鼠的免疫反應是不完整的、異常的，是一種免疫缺陷動物。胸腺分布于健全的小鼠的胸骨柄的后方，毗鄰氣管、位于心臟的腹面，胸腺分左右兩葉，外形呈現乳白色脂肪狀。機體免疫功能的正常與否，與胸腺有著密切的關系，有研究可以證明，胸腺能夠分泌多種表現出生物活性的多肽類物質，統稱為胸腺素[14]。胸腺素能夠促使淋巴組織增殖分化形成新的淋巴細胞；胸腺素已被證實同機體免疫技能有密切的關系，能夠促進來自其他組織的原始淋巴細胞轉變成有免疫活性的T淋巴細胞，進而發揮免疫功能。

為了防止基因突變以恢復裸鼠的免疫功能，常在裸鼠中應用多種免疫學檢測方法來證明其T淋巴細胞處于缺陷的狀態[15]。例如，使用羊紅細胞或者是地鼠的紅細胞反復免疫，T淋巴細胞的免疫功能沒有得到恢復，如果再用三硝基苯基修飾過的上述兩種紅細胞進一步免疫，裸鼠體內沒有產生三硝基抗體，則證明還是原來的裸鼠。除了應用紅細胞進行驗證，用狂犬活疫苗對裸鼠與正常小鼠進行驗證，關于血清中抗體的產生、或者是抗體本身的功能，裸鼠與正常小鼠呈現出不一樣的趨勢，通過該種處理的正常小鼠能表現出良好的免疫功能，而裸鼠無法產生可被檢測到的免疫反應[16]。

IVC獨立送風系統，是應用于小型嚙齒類實驗動物飼養的新一代SPF級、凈化通氣的飼養裝備，可以取代傳統實驗動物飼養的屏障、凈化系統。近些年來在國內許多以小型嚙齒類動物為研究對象的研究室，IVC的應用越來越廣泛。這種在SPF級別上加裝的空氣凈化設備，即不同于過去那種完全的屏障，也不同于開放環境下的IVC安裝。與單純的SPF級屏障系統做比較，三級凈化空調機組耗電量降低，由于IVC系統本身運行所需要的耗電量很低，因此IVC的應用能夠節省運營成本[17]。空氣進入IVC系統前，經過了三級空調凈化后，又經過了IVC主機與各個籠盒的凈化，裸鼠所呼吸到的空氣處于一個相對潔凈的狀態。由于進入IVC系統之前，空氣已經被過濾，這樣的操作能夠在一定程度長延長IVC系統的使用壽命與效率。這樣，既能保證了裸鼠生長繁殖的微環境處于SPF狀態，也能防止裸鼠之間相互傳染疾病，同時對研究人員的身體健康起到了保護的作用。由于裸鼠沒有毛發進行包被與保護，其適于裸體小鼠的室溫為26～28 ℃（78～820 F），

其散失體溫較有毛小鼠為快。處于連續空氣層流中，它們的散熱更快，需要大約28 ℃（800 F）的室溫予以補償。一般飼料室內溫度控制在（25±1）℃也可以。如果裸鼠和有毛雜合子鼠同籠飼養時室溫可略低一點。飼料在連續空氣層流室中的裸鼠需要將層流室內溫度提高到28 ℃。相對濕度應保持在40%～60%，此時，成年裸體小鼠皮膚水分散失最少。濕度過低，對新生裸鼠生存不利，這在空氣層流環境中尤為重要。

IVC獨立送風系統的良好運行，關鍵在于送、排風系統的設計與安裝。以國外先進設備為基礎，將動物福利考慮在內，IVC籠盒內的空氣流向應該使得過濾凈化后的空氣均勻平穩的分布在內，構成正壓風幕，避免過強氣流的產生[18]。要防止籠盒內的裸鼠特別是新生的仔鼠，由于風速過大、通風過度而出現脫水的現象，與其他普通小鼠相比，沒有毛發包裹的裸鼠更容易脫水致死。除了籠盒上部的氣流，籠盒下部也應該有均勻穩定的氣流通過，以使得墊料處于干燥的狀態，將裸鼠代謝產生的異位一并排出。送、排風系統的設計需要適用于整體（小于

5 kPa）或分體式獨立通風籠具的設計與制作[19]。

經過改良育種后的遠交系無胸腺裸鼠，依據有無IVC分為研究組與對照組。對照組的分娩間隔（41.2±2.7）d與研究組（43.7±2.8）d比較，差異無統計學意義（P>0.05），而對照組平均每胎產仔數為（7.8±1.4）只，研究組為（7.9±2.8）只，兩組比較差異無統計學意義（P>0.05），這說明在裸鼠繁育中應用IVC系統對其生育能力沒有顯著影響。新生的仔鼠出生8周即性成熟后，對照組的存活率為（76.9±3.4）%，顯著低于研究組的（86.4±1.7）%（P<0.05）。

綜上所述，在裸鼠繁育的過程中，應用IVC獨立送風系統，對裸鼠的生育能力沒有影響的同時還能夠顯著性的提升新生仔鼠的存活率，使擴群的速度與質量得到有效的保證，為下一步進行免疫學方面的研究或者是構建多種人惡性腫瘤的模型奠定了堅實的基礎，在臨床研究中具有較大的應用價值。

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（收稿日期：2018-06-06） （本文編輯：張爽）