水稻葉色突變研究進展

趙紹路，劉 凱，宛柏杰，朱靜雯，劉艷艷，唐紅生，嚴國紅，孫明法

（江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇鹽城224000）

水稻是我國主要的糧食作物，也是基因功能研究的模式植物。提高水稻葉片中的葉綠素含量，可以增加水稻的生物產量，因而具有超高產潛力的水稻品種往往表現為植株光合作用能力強，后期不早衰，抗逆性也顯著高于一般品種。水稻收獲籽粒中80%以上的干物質是開花以后通過光合作用獲得的[1]，因此對水稻葉色突變體的研究將有助于探索植物光合作用、光形態建成、葉綠素生物合成與降解途徑的分子機制等生理過程。目前水稻葉色突變體已直接應用于雜交水稻制種和F1種子純度鑒定中，具有廣闊的市場前景。因此通過不斷挖掘新的水稻葉色變異材料，闡述水稻葉色突變基因的分子遺傳機制，將具有重要的理論和實踐價值。

1 水稻葉色突變的概念

水稻葉色突變是自然界中比較常見的一種突變性狀，一般是指葉片中葉綠素的合成或降解受到不可避免的影響，從而造成葉綠素含量的改變，表現出不正常的綠色。前期研究者認為葉色突變可能會影響植株的光合作用，抑制水稻的正常生長，進而造成農作物減產。葉色突變材料是研究植物光合效率、葉綠體產生、葉綠體結構、葉綠素合成和代謝途徑及其分子遺傳機制的理想對象[2]。到目前為止，在其他植物中，如擬南芥[3]、菊花[4]、羊茅[5]等多種植物中均有葉色變異材料的報道。

2 水稻葉色突變體的分類

水稻葉色突變體除了少量的自然突變以外，絕大部分是研究者通過物理誘變、化學誘變、射線輻射以及T-DNA插入等方式誘發獲得的突變，因此水稻葉色突變體的變異類型十分豐富，一般根據苗期不同的葉色表現可將其劃分為轉綠型、白化、黃化、條紋、斑馬紋以及黃色斑點共6種類型[6]。也有一些突變體在營養生長期并不表現出葉色變異，到了生殖生長期才有所表現，如水稻滯綠突變體[7]。此外，水稻葉色突變受環境因素的影響較大，例如溫度、光照時間及光照度等，因而劉艷霞等將水稻葉色突變體劃分為高溫敏感型、低溫敏感型和特殊溫敏感型[8]。此外，Kusumi等根據葉色對光照的響應，將其劃分為光誘導依賴和非依賴2種類型[9]。

3 水稻葉色突變相關基因分子遺傳研究

水稻葉色突變體是一類較常見的變異表型，且變異類型較多。迄今為止，國內外對有關水稻葉色突變體的研究很多，據不完全統計，在Gramene（http://www.gramene.org/）網站上已公布的與水稻葉綠素含量相關基因超過140個，它們廣泛分布在第1～第12號染色體上，目前已克隆水稻葉色相關基因37個，但尚未從第12號染色體上克隆出來（表1）。這些葉色基因的定位和克隆為深入闡釋葉綠體功能和代謝途徑的機制分析奠定基礎。根據這些基因在葉綠體內的功能，可將其分為以下幾類：葉綠素合成與代謝途徑相關基因、葉綠體發育途徑相關基因、質-核信號傳導途徑受阻相關基因等，下面作重點闡述。

表1 已克隆水稻葉色相關基因

3.1 葉綠素合成與代謝途徑相關基因研究

葉綠素（chlorophyll,Chl）的生物合成是一個由多個基因和酶調控參與的生化過程，它起始于谷氨酸-tRNA，最終生成葉綠素a和葉綠素b[40]。葉綠素合成途徑中任何一個基因和酶促反應發生變化，都會造成葉綠素合成受阻，引起葉色突變。OsSGR是Jiang等通過γ射線輻射水稻品種日本晴發現的一個與水稻葉綠素降解途徑相關的基因，該基因被定位于水稻第9染色體，編碼一個高度保守的蛋白，是具有水溶性的轉運肽，亞細胞定位于類囊體膜上，在轉錄水平影響葉綠素的降解[7]。Cha等研究表明，OsSGR的功能與葉綠素降解調控有關，通過激發多個葉綠素降解酶（例如NYC、PPH、RCCR、PAO等）直接與LHCPⅡ（light-harvesting complexⅡ）結合，在類囊體膜上形成復合物，誘導LHCPⅡ降解，促使葉綠素的降解[41]。

Morita等利用電離輻射獲得了NYC3突變體，圖位克隆發現該基因位于水稻第6染色體著絲粒附近，編碼1個α/β折疊水解酶家族蛋白，可能是1個葉綠素酶，但沒有葉綠素酶的活性。NYC3在正常衰老葉片中的表達量很低，而在暗誘導后葉片中的表達量很高，在其他非光合組織中，如根部也有少量表達。NYC3突變體在黑暗誘導衰老葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量比野生型高，其他參數如Fv/Fm和細胞膜離子滲漏等指標都下降，說明NYC3是1個非功能型持綠突變體[28]。

Yamatani等利用碳粒子束獲得了另一個水稻持綠突變體NCY4，圖位克隆將該基因定位于第7染色體，為擬南芥THF1的同源基因[32]，而THF1編碼1個多功能蛋白，參與植物體內糖信號轉導、抗病機制和高光馴化等過程[42-43]。NCY4編碼1個類囊體形成蛋白THF1，主要控制葉綠體中內囊體的形成，在葉綠素降解過程中起重要作用。對突變體進行暗處理后受衰老誘導且與葉綠素降解相關的基因，如OsSGR、NYC3、NYC1、NOL、OsRCCR1、OsPAO以及其他衰老誘導基因Osh36都得到上調表達，表明NCY4體內的衰老進程并未受阻，NCY4是1個非功能型突變體。然而與其他持綠突變體如NYC1、OsSGR、NOL和NYC3不同的是，在衰老的過程中NCY4的葉綠素熒光參數如Fv/Fm與野生型相比，維持在較高水平，且PSⅡ亞基的穩定性也比其他非功能型突變體的高。因而在今后的研究中要重點關注功能性的持綠突變體。

3.2 葉綠體發育途徑中相關基因研究

水稻葉綠體是由細胞前質體分化發育而來，與水稻葉片的發育緊密相關。葉綠體的分化發育如果受到影響，將會導致葉綠體內部結構的缺陷、葉片中葉綠素含量以及其他光合色素比例的變化，因此葉綠體的發育也是一個十分復雜的過程。吳殿星等通過掃描電鏡觀察水稻不同葉色變異材料的葉綠體結構后，突變體的表型雖不一樣，但是在突變植株的突變區域里葉綠體的發育均出現異常，發育明顯遲緩[44]。例如溫度對葉綠體發育產生影響，Suginoto等通過圖位克隆的方法定位了一個溫度敏感型葉色突變體V2，它編碼一個位于線粒體上的鳥苷酸激酶，是影響水稻葉綠體發育途徑過程中的關鍵因子，發生突變后該基因會導致水稻葉片出現白化表型[45]。Bang等克隆了ObgC基因，它編碼SpoB相關的三磷酸鳥苷結合蛋白，對于葉綠體的發育非常重要，同時對水稻核糖體的生物合成也起到關鍵作用。ObgC基因敲除后，會導致植株中葉綠體發育延遲，葉片出現黃萎表型[34]。

3.3 核-質信號途徑受阻相關基因研究

水稻核-質信號途徑上的任何一個基因發生突變后，水稻葉綠體的發育就會受阻，并最終導致葉色出現變異。Xu等在水稻中克隆了PAPST1基因，該基因編碼一個3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸轉運蛋白，電鏡觀察發現突變體植株的類囊體發育存在缺陷，因此在水稻葉片發育早期就表現枯黃。亞細胞定位研究表明OsPAPST1基因位于水稻線粒體外膜和葉綠體外膜上，推測其可能作為3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸載體，在細胞核和葉綠體之間起到信號傳導作用[11]。

一般研究認為，水稻核基因組與細胞質基因組之間存在相互關聯，這種作用稱之為核質互作。一方面，細胞核基因控制著質體的發育過程，如水稻核基因OsDVR發生突變后，致使葉綠體發育受到抑制，突變體就會表現出黃綠葉，導致植株生長進程緩慢[16]。另一方面，葉綠體發育受阻或損傷會通過信號反饋途徑調控核基因的表達。在水稻葉綠體中，10%～15%蛋白由核基因編碼，其余部分的蛋白由細胞核和葉綠體共同編碼，兩者之間的相互作用對于葉綠體行使正常功能是必需的。此外，在水稻中葉綠體的發育需要多個轉錄因子的輔助和參與，例如光敏色素互作因子和GLK2蛋白。水稻中定位于細胞核的Cga1就編碼一個細胞分裂素應答的GATA轉錄因子，過表達該基因會導致水稻葉片變深綠、分蘗數減少，相反地，RNAi沉默Cga1則會造成水稻葉片中葉綠素含量減少、葉色變淡、分蘗數增加[14]。目前關于水稻核-質信號轉導途徑過程中的基因機制研究還處于比較初級的階段，需要進一步挖掘葉色變異材料，更深入地闡述該途徑中的分子機制。

4 水稻葉色突變體的應用與展望

植物葉色突變體是研究光合作用調控和葉綠體發育、代謝途徑相關基因功能的快速有效途徑，目前國內外學者已經發現超過190個水稻葉色變異突變體，通過圖位克隆的方法獲得突變基因，并利用分子遺傳學對基因的功能進行了闡述，這些基因為葉綠體的發育機制及光合作用的調控機理提供新的分子依據。

筆者所在課題組于2015年在中熟中粳稻鹽稻8號提純復壯的試驗田中發現1株衰老明顯延緩的滯綠突變體，可以作為優良的種質資源加以利用。經連續多年的種植，表型穩定遺傳，在自然條件下，突變體在苗期、分蘗期、灌漿初期的表型與野生型鹽稻8號無顯著差異，但在灌漿后期葉色仍保持濃綠，尤其是千粒質量極顯著高于野生型。將該基因定位在第4染色體遺傳距離為4.6 cM范圍內，目前正在進行精細定位。同時以突變體為親本配置了大量雜交組合，利用分子標記輔助選擇將有利基因進行聚合育種，以其為培育高產水稻品種提供種質資源。目前已有研究者將葉色變異作為標記導入雜交水稻的母本當中，在雜交制種苗期就可以輕易的去除雜株，從而保持種子的純度[46]。

雖然目前已經克隆了大量的水稻葉色突變基因，有關葉綠體發育、代謝途徑及光合作用調控機理研究取得了不少進展，但葉綠體是一個具有復雜結構和功能的亞細胞系統，還存在許多未知的途徑，所以葉綠體的發育機制及光合作用的調控機理還有待進一步的研究。需要學者發現更多的葉色變異，從基因層面上改良農作物，獲得高光效的作物新品種，這對于保證我國糧食產量、促進農業生產和諧發展具有重要意義。