“葉綠體色素的提取與分離”實驗教學

左小龍 喬秀芹

（1 北京市順義牛欄山第一中學 北京 101301 2 北京市順義區(qū)教育研究和教師研修中心 北京 101300）

1 實驗內(nèi)容分析

在生物學教學中，教師應積極提供機會讓學生親自嘗試和實踐，并依據(jù)觀察到的事實進行深度思考［1］，進而加深對生物學概念的理解，提升應用知識的能力。“葉綠體色素的提取和分離”是《普通高中生物課程標準》中必修1“細胞的代謝”單元中的重要實驗。通過此實驗可讓學生認識葉綠體色素的種類和顏色，了解葉片呈現(xiàn)綠色這一表象背后的實質(zhì)，進而為光合作用過程和應用的學習奠定基礎，同時體會層析原理及層析法在物質(zhì)分離中的重要作用。

由于葉綠體中色素為脂溶性，且不同色素在有機溶劑中的溶解度不同，因此人教版教材中的此實驗以無水乙醇為提取液，以石油醚∶丙酮∶苯=20∶2∶1 的混合有機溶劑作為層析液，再用濾紙條作為分離介質(zhì)，完成對葉綠體色素的提取和分離。此實驗能讓學生了解葉綠體色素的種類和顏色，但層析液中含有致癌物質(zhì)苯［2］，影響師生的健康；劃濾液細線時易出現(xiàn)細線過寬且色素含量少的情況；層析后色素帶不整齊、不明顯清晰［3］；學生完成此實驗后，對層析液的組成和層析原理可能存在認識誤區(qū)，例如認為層析液只能是教材中的固定配比、層析后色素條帶的順序是固定不變的等。

鑒于此，筆者對該實驗進行了一系列改進和延伸，旨在讓學生更加深刻地理解層析技術(shù)及其原理，弄清葉綠體色素的種類和功能。改進方案，遵循簡單化原則，在保證實驗效果理想的前提下，降低對實驗儀器的要求，同時簡化操作步驟，以便更廣泛地開展學生實驗。

2 實驗教學準備

2.1 實驗材料與用具

1）材料：新鮮菠菜葉。

2）試劑：提取液（無水乙醇∶石油醚=2∶3）、層析液（石油醚∶丙酮=5∶4）、蒸餾水、二氧化硅、碳酸鈣。

3）用具：研缽、稱量紙、剪刀、藥匙、天平、玻璃漏斗、濾紙、試管、移液管、吸耳球、試管架、硅膠G 層析板（青島海洋化工廠）、毛細吸管、燒杯、培養(yǎng)皿蓋、離心機、1.5 mL 離心管、1 000 μL 移液器、比色皿（0.5 cm 厚）、刀片、三棱鏡。

硅膠層析板的處理： 直接購買的硅膠G 層析板（青島海洋化工廠）規(guī)格為20 cm×10 cm，使用前需先置于烘箱中，60℃下烘干1 h，然后用玻璃刀從背面進行切割，切割成2 cm（寬）×10 cm（長）規(guī)格，此項操作需一定的技巧，由教師在課前完成。

2.2 實驗報告單 為了培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力和探究思維，本實驗先不給出實驗原理，也未將可能出現(xiàn)的現(xiàn)象告訴學生，而是設計成探究性問題放在討論分析中。現(xiàn)象不是教師告知的，而是學生自己觀察發(fā)現(xiàn)的；原理不是教師講解的，而是學生自主查閱和研究獲得的［4］。

課前發(fā)放實驗報告單，學生熟悉實驗操作過程。實驗報告單設計如表1。

表1 “葉綠體色素的提取與分離”實驗報告單

3 實驗教學組織

3.1 色素提取 取5 g 新鮮菠菜葉，剪碎，置于研缽中。向研缽中加入少許二氧化硅和碳酸鈣，再加入提取液10 mL，迅速、充分地進行研磨［5］。將研磨液迅速倒入玻璃漏斗中進行過濾，濾液收集到試管中后，加入與濾液等體積的蒸餾水，此時試管中液體出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，即色素溶于石油醚在上層，無水乙醇進入水層在下層。用移液管吸取上層深綠色濾液轉(zhuǎn)移至小燒杯中。由于經(jīng)過了一次萃取，加上石油醚易揮發(fā)，所以改進后的色素提取方法可極大提高濾液中色素的濃度，從色素提取液的顏色上可直觀反映。

3.2 色素分離 嘗試用薄層層析法取代原實驗中的紙層析法。薄層層析法是一種較新的分離物質(zhì)的方法，具有快速、微量、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點。筆者在實驗中用硅膠G 層析板代替濾紙。硅膠G 層析板吸附能力強，能承載更為大量的色素，且質(zhì)地均勻，分離的色素條帶更加清晰、整齊。

分離色素的過程如下：

1）層析液的配制：薄層層析的層析液由5 份石油醚和4 份丙酮混合而成。將9 mL 層析液加至250 mL 燒杯中，蓋好培養(yǎng)皿蓋靜置10 min，使氣態(tài)相達到飽和。

2）畫濾液細線：用毛細吸管吸取適量濾液，在硅膠板的一端距邊緣1 cm 處，從左至右不間斷地快速畫線。由于此時濾液中的石油醚揮發(fā)較快，因此能迅速干燥，短暫間隔后，再重復3～4 次，確保硅膠板上吸附有足量的色素。

3）層析：將劃好濾液細線的硅膠板有濾液細線的一側(cè)朝下放入燒杯，蓋好培養(yǎng)皿進行色素的分離，透過燒杯，學生可清晰觀察到層析過程。

由于硅膠板比較硬，所以濾液細線不會沒入層析液中；一個燒杯中可放數(shù)個硅膠板，且彼此互不干擾。層析的速度也很快，硅膠板從上至下依次能觀察到胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素，還能觀察到呈褐色的去鎂葉綠素和橙黃色的姜黃素，色素帶直且齊。

為了使學生更直觀地認識葉綠體中色素在光合作用中的作用，筆者在教學中對此實驗進行了拓展和延伸。

3.3 單一色素的再提取 用刀片將硅膠板上的胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素4 條色素條帶（含硅膠粉末）分別刮下來，按4 人小組分類集中，再將含有4 種不同色素的硅膠粉末分別置于1.5 mL 離心管內(nèi)，加入適量無水乙醇，用毛細吸管進行攪拌混勻，以2 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min，然后用1 000 μL 移液器吸取上層濾液，獲得4 種單一色素的提取液（圖1），分別置于0.5 cm 厚的比色皿中。

圖1 單一色素的再提取

3.4 不同色素吸收光譜的測定 在實驗臺上讓直射白光通過三棱鏡，可在后方白板上看到七色光譜。將盛有4 種不同色素的的提取液分別置于三棱鏡和白板之間，則可觀測到不同色素對不同顏色光的吸收不同。結(jié)果顯示：葉黃素和胡蘿卜素主要吸收藍紫光，葉綠素a 和葉綠素b 主要吸收紅光和藍紫光，仔細觀察還會發(fā)現(xiàn)，在紅光區(qū)葉綠素a 相比葉綠素b 有更大的吸收能力。

圖2 葉綠體色素的熒光現(xiàn)象

3.5 熒光現(xiàn)象觀察 將色素提取液置于試管之中，用燈光照射，可清晰觀察到葉綠素在透射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色，即熒光現(xiàn)象（圖2）。

4 實驗教學傳遞的重要概念

本實驗對葉綠體色素的提取和分離方法進行了改進，對色素功能的探索進行了延伸，將葉綠體色素的種類和功能這2 部分知識緊密聯(lián)系在一起。學生親歷了實驗的全過程，并在此過程中加深了對重要概念的理解。

1）教材實驗的結(jié)果讓學生明白了葉綠體色素的種類和顏色。其中，提取方法的改進突顯出葉綠體色素的脂溶性特點：用石油醚和無水乙醇提取，再進一步用水分層，前、后2 次操作能充分體現(xiàn)色素易溶于有機溶劑的特點。層析方法的改進有助于學生加深對層析原理的理解： 用薄層層析法替代紙層析，這一介質(zhì)的替換，讓學生對層析法這一物質(zhì)分離技術(shù)有了新的認識，而替代后出現(xiàn)的與紙層析不同的實驗結(jié)果更是引發(fā)了學生的思考，學生更易理解條帶順序與層析液的組成和配比有關(guān)，與不同色素在層析液中的溶解度不同有關(guān)。

2）拓展實驗中吸收光譜的測定有助于學生對葉綠體色素功能的理解； 熒光現(xiàn)象的觀察能引發(fā)學生深入思考，為光合作用過程的學習奠定基礎：綠色葉片在自然狀態(tài)下為何觀察不到熒光？ 葉綠體內(nèi)的色素吸收的光能去哪了？ 學生帶著問題走出實驗室，進一步尋找答案，這樣既激發(fā)其繼續(xù)學習和探究的欲望，也讓實驗與理論在內(nèi)容和邏輯上聯(lián)系得更加緊密。