基于不同熒光納米粒子的免疫層析技術及其在食品安全檢測中的應用

◎ 吳民富，李 莎，蔡津津，林柔珍，崔寶儀，廖杰靈，梁祖培

（1．佛山職業技術學院食品科學系，廣東 佛山 528137；2．廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

Wu Minfu1， Li Sha1， Cai Jinjin1， Lin Rouzhen1， Cui Baoyi1， Liao Jieling1， Liang Zupei2

（1.Department of Food Science， Foshan Vocational and Technical College， Foshan 528137， China；2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision， Foshan 528300， China)

免疫層析檢測試紙條（Immunochromatographic test strips，ICTSs）技術從20世紀90年代開始迅速發展，是一種快速、簡便的分析技術。ICTSs把層析技術的便捷性和免疫反應的快捷、高靈敏等優點結合起來，具有簡單、快捷、靈敏度高、特異性強等優點[1]。目前，用于ICTSs中的標記納米探針多來越多，如膠體金、熒光納米材料、磁性納米材料、復合納米材料等，其中以膠體金探針報道的最多[2]。但免疫層析試紙存在的缺點就是難以達到檢測限標準。目前可從兩方面解決此問題：①采用定量檢測，當前已經大量報道。②采用新型標記材料，如采用熒光納米材料來提高試紙條檢測的靈敏度。

1 免疫層析分析技術

免疫層析技術將免疫分析技術和色譜層析技術相結合，在環境分析、臨床診斷、食品安全檢測等領域廣泛應用。其原理是通過對抗原或抗體進行標記，采用雙抗體夾心法或競爭法對待測物進行檢測。雙抗體夾心檢測法利用捕獲抗體和檢測抗體對待測物進行分析，一般用于檢測分子量較大的抗原或抗體，因為生物大分子常含有兩個或以上的抗原決定簇（Antigenic determinant）。競爭法常用于小分子物質的檢測，小分子物質通常只有一個抗原決定簇，常采用競爭免疫試驗進行檢測。競爭法又分為直接競爭法和間接競爭法兩種。

2 免疫層析技術中常用的熒光納米材料及其在食品安全分析中的應用

2.1 熒光納米材料

納米材料是尺寸在1～100 nm范圍內的材料的統稱，具有體積效應、表面效應和量子尺寸效應等。而熒光納米粒子由于其獨特的光學性質，廣泛地應用于醫學診斷、環境監測、食品安全檢測中。與其他傳統的熒光材料相比，熒光納米材料熒光強度高、穩定性好，不易被光漂白；熒光納米材料斯托克斯位移大，發射波長窄且對稱。一些特殊的熒光納米材料，能夠通過控制尺寸的大小來改變發射波長，從而實現多重標記的同步分析。現在越來越多的報道將熒光納米材料與儀器的定量檢測結合在一起，來提高免疫層析試紙條技術的靈敏度，使得免疫層析技術在快捷簡便、能夠實現現場篩選的同時，也能夠達到檢測限的需要。

2.2 常用的熒光材料在免疫層析技術中的應用

2.2.1 量子點

量子點主要由Ⅱ～Ⅳ族、Ⅲ～Ⅴ族元素組成，是一類半導體熒光納米材料。量子點具有比表面積大、生物相容性好等優點[3]，且具有激發波長范圍較寬，斯托克斯位移大等優良的光化學性質。故可采用同一激發光激發不同粒徑量子點進行同時檢測，實現多殘留分析。Taranova等[4]采用不同粒徑的量子點對食品中3種抗生素開展免疫層析檢測，檢測限比傳統的ELISA方法高80～200倍，大大降低了檢測閾值。量子點熒光材料的發射波長可以根據改變量子點的大小和組成來改變，且可跨域紫外到紅外區間[5]。

量子點具有的熒光強度高、穩定性好、熒光壽命長、生物相容性良好等優點，使其在免疫層析技術中的應用越來越廣泛。張蕾等[6]通過水相法合成CdTe量子點熒光材料，采用EDC法偶聯抗體檢測蝦肉中的呋喃唑酮，檢測限達到10 mg·mL-1。有研究人員采用微乳膠技術將量子點包裹，以解決量子點聚沉的問題，通過信號放大提高檢測的靈敏度。Ren等[7]采用微乳技術將CdSe/ZnS量子點包裹成表面帶羧基的微球，建立免疫分析方法對玉米中黃曲霉毒素檢測半抑制濃度（IC50）為 13.87 pg·mL-1，檢測限達 0.42 pg·mL-1，比單獨使用量子點、標記的試紙條的靈敏度提升39倍，可用于食品安全現場快速檢測。Duan等[8]采用量子點微球免疫層析法檢測玉米提取物中的玉米烯酮毒素，檢測限為3.6 μg·kg-1。有研究者將待檢測物標記量子點，抗體包被在檢測線上來設計競爭反應。

量子點免疫層析分析方法簡單、快速、靈敏度高，適合食品安全現場篩查。定量檢測的量子點試紙條靈敏度比膠體金免疫層析試紙條要高，逐漸成為免疫層析分析技術研究的熱點。

2.2.2 稀土材料

稀土材料是由鑭系稀土元素或者其摻雜于惰性材料組成的納米晶體粒子[9]。根據斯托可斯位移的不同，稀土納米材料分為上轉換和下轉換熒光材料。上轉換熒光材料信號比較穩定，不容易受環境和背景干擾的影響，因此可有效提高檢測靈敏度。Wu等[10]利用上轉換熒光粒子同時檢測金黃色葡萄球菌等3種食源性致病菌。下轉換熒光材料具有超長的發射光半衰期，經延長測量時間，可消除背景熒光提高檢測的靈敏度。李靜等[11]結合時間分辨熒光技術與免疫層析技術，對油料餅粕中的黃曲霉毒素B1進行檢測。回收率在70%～120%，且對單個樣品檢測時間低于15 min可應用于大批量油料餅粕的分析檢驗。丁小霞等[12]采用Eu3+硅膠熒光微粒建立黃曲霉毒素B1時間分辨熒光免疫層析法，比膠體金免疫層析法的靈敏度提高1個數量級以上。該方法對花生、植物油等農產品的檢出限為0.3 μg·kg-1。

2.2.3 高分子熒光納米微球

高分子熒光納米微球是負載有機熒光染料分子的無機納米顆粒或多聚生物大分子包被納米顆粒[13]，以聚苯乙烯、聚丙烯酰胺類等為主體。納米微球對可保護鎖包裹的熒光染料，避免環境對材料的影響。納米顆粒內部包裹的熒光數量較多，可放大檢測信號，提高檢測靈敏度。Liu等[14]采用熒光微球探針建立免疫分析方法，對醬油中黃曲霉毒素B1進行檢測，檢出限達到2.5 μg·L-1。Zang等[15]建立基于熒光微球的免疫層析技術對玉米中的黃曲霉毒素B1進行定量檢測，回收率在91%～118%。

2.2.4 復合熒光納米粒子

復合熒光納米材料采用多種納米材料進行復合，使得復合物具有每種單一材料的優點。常見的二氧化硅納米復合材料由功能化的內核、可進行生物功能化的硅外殼以及表面生物分子構成。該類納米顆粒內核常采用油包水（W/O）反相微乳液方法合成，通過硅烷化試劑進行包殼，通過生物功能化對納米顆粒的表面進行生物分子修飾。復合熒光二氧化硅納米粒子具有良好的分散性，合成條件較為溫和，在食品安全檢測領域得到廣泛的應用。Song等[16]采用SiO2包裹Eu(Ⅲ)–BHHCT制備SiO2熒光納米復合材料，建立免疫層析法對β-興奮劑進行檢測，肉眼觀察法LOD為 0.1 ng·mL-1，儀器檢測法 LOD 為 0.037 ng·mL-1，檢測限遠低于膠體金免疫層析試紙條。不同熒光納米粒子在食品安全檢測中的應用見表1。

表1 不同熒光納米粒子在食品安全檢測中的應用表

3 結論展望

免疫層析分析技術近年來發展迅速，主要的發展方向有：①通過信號放大結合檢測儀器可提高檢測的靈敏度。采用納米磁分離技術、生物素-親和素技術或采用新型生物分子標記物。②實現半定量和定量檢測。定性檢測的結果通常靈敏度較低，難以滿足檢測的要求，因此可通過采用檢測靈敏度更高的標記物或通過確定檢測帶的顯色時間對待測物進行定量。③實現同時對多種分析物的檢測，可采用熒光微球或鑭系元素同時檢測多種物質。多標記測定技術可節省前處理時間和步驟，檢測速度，具有很大的應用價值。