微小RNA—200a對肺癌細胞增殖影響及抑癌基因功能分析

謝悅　　董禮文　　王軍　　李雄偉

[摘要] 目的 分析miRNA-200a對肺癌細胞增殖影響及抑癌基因功能影響。 方法 Real-time PCR對正常肺支氣管上皮細胞16HBE、肺癌細胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小細胞癌癌旁組織與癌組織內miR-200a表達量檢測，CCK-8法檢測肺癌A549細胞增殖活性受miRNA-200a影響狀況，生物信息學對miRNA-200a靶基因進行預測，雙熒光素酶聯合Western blot及Real-time PCR檢驗YAP1受miRNA-200a調控影響。CCK-8法檢測肺癌549細胞受YAP1增殖影響。 結果 肺癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549內miR-200a表達量均低于正常細胞株16HBE，差異有統計學意義（P<0.05）。miR-200a mimics組內A549細胞在48、72及96 h時其吸光度均低于Mimics-NC，差異有統計學意義（P<0.05）。肺癌A549轉染siRNA-NC或者siRNA-YAP1后，PCR檢測顯示siRNA-YAP1內YAP1 mRNA表達量為（0.37±0.06），siRNA-NC內YAP1 mRNA表達量為（1.03±0.07），差異有統計學意義（P<0.05）；Western blot顯示siRNA-YAP1內YAP1蛋白表達量比siRNA-NC低；siRNA-YAP1內YAP1細胞吸光度在48、72及96 h時均低于siRNA-NC，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 miR-200a對肺癌細胞增殖的抑制作用主要是經過靶向作用YAP1基因來實現的，進而在肺癌內起到抑癌功能。

[關鍵詞] 肺癌；miRNA-200a；YAP1；細胞增殖

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）31-0020-05

Analysis on the effect of microRNA-200a on proliferation of lung cancer cells and function of tumor suppressor gene

XIE Yue DONG Liwen WANG Jun LI Xiongwei

Department of Cardiothoracic Surgery，Hangzhou Hospital of TCM，Affiliated Guangxing Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310000，China

[Abstract] Objective To analyze the effects of miRNA-200a on the proliferation of lung cancer cells and the function of tumor suppressor genes. Methods Real-time PCR was used to detect the expression quantity of miR-200a in normal lung bronchial epithelial cells 16HBE， lung cancer cells SK-MES-1， NCI-H520， A549 and non-small cell carcinoma para-carcinoma tissue tissues and cancer tissues in 25 cases. CCK-8 assay was used to detect the effect of miRNA-200a on the proliferation activity of lung cancer A549 cells. Bioinformatics was used to predict miRNA-200a target genes， and dual fluorescein combined with Western blot and Real-time PCR were used to detect the effect of miRNA-200a regulation on YAP1. CCK-8 assay was used to detect the effect of YAP1 proliferation on lung cancer 549 cells. Results The expression quantity of miR-200a in lung cancer cell lines SK-MES-1， NCI-H520 and A549 was lower than that in normal cell line 16HBE， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The absorbance of A549 cells in miR-200a mimics group was lower than that of Mimics-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. After lung cancer A549 was transfected with siRNA-NC or siRNA-YAP1， PCR detection showed that the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-YAP1 was（0.37±0.06）， and the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-NC was（1.03±0.07）. The difference was statistically significant（P<0.05）； Western blot showed that the expression quantity of YAP1 protein in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC； the absorbance of YAP1 cells in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The inhibitory effect of miR-200a on the proliferation of lung cancer cells is mainly achieved by targeting the YAP1 gene， which in turn plays a tumor suppressor function in lung cancer.

[Key words] Lung cancer； miRNA-200a； YAP1； Cell proliferation

肺癌為臨床常見腫瘤，特別是近些年來，隨著人們生活環境和生活方式的改變，肺癌發病率逐漸升高，對人們的生命安全產生了嚴重影響。伴隨生物技術不斷深入探究，腫瘤療法的一個新的研究熱點為驅動基因分子靶向療法，為臨床患者提供了新的治療手段。微小RNA（miRNAs）為長度17～25個核苷酸高度保守、內源性單鏈非編碼RNA，能夠結合下游3-非編碼區（3-UTR），可使mRNA降解或在轉錄后對其翻譯起抑制作用，在機體腫瘤進展中有“抑癌基因”或“癌基因”影響[1-2]。miR-200家族一員miR-200a定位在機體好的染色體內，相關研究顯示，機體惡性腫瘤進展和miR-200a的異常表達有一定聯系，在多數腫瘤內如肝癌、胰腺癌、腎細胞癌等miR-200a表達量降低，有“抑癌基因”影響，同時有研究顯示，在卵巢癌及鼻咽癌等腫瘤內其表達升高，有“癌基因”影響[3-4]。因此，本研究通過分析miRNA-200a對肺癌細胞增殖影響及抑癌基因功能影響，為臨床患者治療提供一些實驗室依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

組織標本：選取2017年3月～2018年1月間在本院進行手術的非小細胞肺癌患者25例，收集其肺癌組織及癌旁組織（離腫瘤邊緣5 cm以上），置于液氮并保存于-80℃冰箱內，肺癌患者均經過病理切片確診，其中男17例，女8例，年齡40～65歲，平均（55.37±6.81）歲，依據WHO肺癌分類，腺鱗癌2例、鱗癌9例，腺癌14例。本文研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬知情并簽署同意書。

試劑和細胞：β-cation及YPA1抗體（由美國Abcam公司生產），正常肺支氣管上皮細胞株16HBE、肺鱗癌細胞系SK-MES-1、NCI-H520及非腺癌細胞系A549（由美國ATCC公司生產），CCK-8試劑盒（由上海東仁化學公司生產），LipofectamineTM2000、Trizol試劑（由美國Invitrogen公司生產），YAP1 siRNA質粒、陰性對照mimics-NC、miR-200a mimics、siRNA-NC（由美國Santa Cruz公司生產），YAP1、miR-200a和內參GAPDH、U6引物均為上海吉瑪公司合成，pmirGLO載體、RNA逆轉錄試劑盒、雙熒光素酶試劑盒及Real-time PCR試劑盒（由美國Promega公司生產）。

1.2 研究方法

1.2.1 培養細胞與轉染 16HBE、SK-MES-1、NCI-H520和人肺癌細胞株A549均放置在RPMI 1640培養基（包含10%胎牛血清）內，含5% CO2、37℃培養箱內進行培養，2～3 d按照1：3進行傳代。細胞培養板內選取A549對數生長期肺癌細胞進行接種，細胞貼壁在70%～80%行轉染，依據LipofectamineTM2000試劑盒的說明來行相關操作，對siRNA-NA、miRNA-200a mimics、siRNA-YAP1及mimice-NC轉染。

1.2.2 Real-time PCR對YAP1 mRNA、miR-200a進行檢測 Trizol試劑對細胞或者組織總RNA進行提取，并檢測RNA含量，選取總RNA 1 mg依據逆轉錄試劑盒的說明反轉錄獲取cDNA。Real-PCR體系，反應條件：95℃下3 min、95℃下10 s、59℃下30 s，共進行40循環。內參為U6/GAPDH，2-△△Ct計算YAP1、miR-200a mRNA表達量。

1.2.3 Western blot對YAP1蛋白表達量檢測 轉染48 h后采集細胞，PBS洗滌3次，細胞總蛋白使用蛋白裂解液提取，蛋白含量使用BCA法檢測。選取蛋白40 mg上樣，在SDS-PAGE電泳30 min，而后將蛋白質轉移到PVDF膜內，5%脫脂奶粉封閉液加入，在室溫下封閉2 h，β-actio、YAPA1一抗加入，在0℃下過夜，第2天洗膜，二抗加入后在室溫下孵育2 h，洗膜ECL發光劑加入，凝膠成像顯影，YPA1和β-actin的蛋白條帶灰度比值為YPA1表達量。

1.2.4 CCK-8對細胞增殖活力檢測 96孔板內接種轉染24 h后細胞，行常規培養，依據CCK-8試劑盒說明在轉染24、48、72及96 h時加入CCK-8溶液10 mL，在劑量為50 mL/L的CO2、37℃培養箱內孵育2 h，450 nm吸光度使用酶標儀檢測，重復3次。

1.2.5 預測miR-200a靶基因和雙熒光素酶驗證 使用miRNA靶基因的預測軟件miRanda聯合基因功能分析，篩出miR-200a直接靶基因可能為YAP1。帶有突變型聯合位點熒光載體pmirGLO-YAP1-mtUTR與帶野生型聯合位點熒光載體pmirGLO-YAP1-wtUTR由上海吉瑪公司構建。行轉染前1 d，24板孔內接種肺癌A549細胞，在轉染當前把測序驗證正確pmirGLO-YAP1-mtUTR或者pmirGLO-YAP1-wtUTR熒光載體和mimics-NC或者miR-200a mimics對肺癌A549進行轉染，并分成四組，在轉染48 h后采集細胞，依據雙熒光素酶活性說明書對海腎熒光素酶、螢火蟲熒光素酶活性檢測。熒光酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.3 統計學方法

使用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料且符合正態分布以（x±s）表示，采用t檢驗或方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1非小細胞肺癌細胞及組織內miR-200a表達狀況

肺癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549內miR-200a表達量均低于正常細胞株16HBE，差異有統計學意義（P<0.05）（表1），且A549內表達量最低，所以在后續研究中選取A549。

2.2 miR-200a表達上調對肺癌細胞A549增殖活力抑制狀況

PCR檢測顯示A549轉染以后miR-200a mimics細胞內miR-200a的表達量為（5.61±0.42），轉染Mimic-NC組細胞內miR-200a表達量為（1.05±0.40），差異有統計學意義（t=4.072，P<0.05），說明轉染效果比較高。CCk-8檢測顯示miR-200a mimics組內A549細胞在48、72及96 h時其吸光度均低于Mimics-NC，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 miR-200a直接調控靶基因為YAP1

采用miRanda靶基因預測數據庫聯合基因功能顯示，YAP1可能為miR-200a靶基因，miR-200a種子序列和YAP1 3-UTR在理論上有互補結合位點。miR-200a mimics結合野生型YAP1-wtUTR后其細胞熒光素酶活性比低于miR-200a mimics結合野生型YAP1-wtUTR，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 miR-200a上調后對YAP1蛋白及mRNA表達抑制影響

PCR檢測顯示，miR-200a內YAP1 mRNA表達量為（0.54±0.07），Mimics-N內YAP1 mRNA表達量為（1.07±0.09），差異有統計學意義（t=4.071，P<0.05），Western blot顯示miR-200a內YAP1蛋白表達量比Mimics-NC低。見圖1。

2.5 YAP1下調對肺癌A549增殖活力抑制狀況

肺癌A549轉染siRNA-NC或siRNA-YAP1后，PCR檢測顯示siRNA-YAP1內YAP1 mRNA表達量為（0.37±0.06），siRNA-NC內YAP1 mRNA表達量為（1.03±0.07），差異有統計學意義（t=4.180，P<0.05）；Western blot顯示siRNA-YAP1內YAP1蛋白表達量比siRNA-NC低（圖2）；CCk-8檢測顯示siRNA-YAP1內YAP1細胞吸光度在48、72及96 h時均低于siRNA-NC，差異有統計學意義（P<0.05）（表4）。

3 討論

miR-200a是miR-200成員之一，當前相關研究顯示機體惡性腫瘤和miR-200a異常表達聯系緊密[5]，Gao SL等[6]研究顯示，神經母細胞瘤內miR-200a表達量比癌旁組織顯著下降，而miR-200a表達上調后可經過靶向AP-2γ基因對成瘤及腫瘤細胞增殖有抑制作用。Yao J等[7]研究表明乳腺癌患者機體內miR-200a表達量降低，而miR-200a表達上調后可經過靶向TFAM基因對腫瘤細胞增殖起到抑制作用。本研究經過Real-time PCR對正常肺支氣管上皮細胞16HBE、肺癌細胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小細胞癌癌旁組織與癌組織內miR-200a表達量檢測顯示，肺癌細胞系及非小細胞肺癌組織內miR-200a表達量均顯著下降，和其他相關研究一致。為進一步分析miR-200a對于肺癌細胞的增殖狀況，本研究經過脂質體介導把miR-200a mimics轉染到肺癌A549細胞內，A549細胞成功過表達miR-200a。CCK-8檢測顯示，miR-200a過量表達對肺癌A549細胞增殖活力有抑制作用，說明miR-200a對肺癌細胞增殖有抑制影響，為肺癌的“抑癌基因”。

一個miRNA能夠參加到多個靶基因的調控，同時每個靶基因會受到數個miRNA進行同時調控。在腫瘤內miRNA影響取決于調控下游靶基因內生物學效應[8-10]。Chen Y等[11]研究顯示，miR-200a能夠經過靶向TSOAN1對肺癌細胞侵襲起到抑制作用。Zhen Q等[12]研究表明miR-200a可經過靶向c-Met及EGFR對肺癌細胞轉移和侵襲起到抑制影響。為分析miR-200a對于肺癌細胞增殖相關機制，本研究采用靶基因的預測數據庫，同時聯合基因功能進行判別，結果顯示YAP1可能為miR-200a靶基因，miR-200a種子序列和YAP1 3UTR區在理論上其結合位點可互補，經過雙熒光素酶驗證miR-200a可和YAP1 3UTR區特異性聯合，降低熒光蛋白表達量，為更進一步證明miR-200a靶基因是否是YAP1，使用Western blot與Real time PCR檢測顯示miR-200a表達上調后可使YAP1蛋白及mRNA表達量下降，說明miR-200a對于YAP1基因有負調控影響，也驗證了miR-200a直接靶基因為YAP1。YAP1為Hippo信號路徑下游的信號分子，對于機體內源性穩態、DNA修復及細胞生長發育有重要影響[13-15]。相關研究顯示，YAP1在正常活化狀況時加速機體修復創傷，而在超激活狀況時對細胞增殖有加速作用，促進產生腫瘤[16-18]。本研究經過YAP1表達量下調對肺癌A549細胞增殖有抑制作用，與miR-200a表達上調對肺癌A549細胞影響一致，由此說明miR-200a可經過調控YAP1基因而對肺癌細胞增殖發揮作用，與王新勝[19]關于 MicroRNA-200a靶向調控對腎細胞癌生物學行為影響相近，值得給予關注。有報道研究顯示很多肺癌組織內都有S期激酶相關蛋白2，而且隨著腫瘤惡性程度的增加體內S期激酶相關蛋白2表達也顯著加強，S期激酶的相關蛋白2則和磷酸化細胞周期的負性調控因子p27表達為負相關[20]，S期激酶相關蛋白2能夠特異性辨別抑癌的基因p27，經過泛素化路徑使p27降解，細胞周期出現異常調控，參加了肺癌細胞的增殖與發展。

綜上所述，miR-200a對肺癌細胞增殖的抑制作用主要是經過靶向作用YAP1基因來實現的，進而在肺癌內起到抑癌功能。

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（收稿日期：2018-07-12）