數字PCR技術及其在微生物檢測中的應用

◎ 吳 冰，蔡先全，鄭傳發，邱 霞，蕭綺倩

（中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東 中山 528403）

1999年，Kenneth Kinzler與Vogelstein B提出了“數字PCR（Digital PCR，dPCR）”的概念[1]，該技術將DNA或RNA樣品分散成大量的微反應單元，然后對眾多微反應單元內的靶序列進行單分子模板PCR擴增、熒光檢測和統計學分析，實現絕對定量。該技術不依賴標準曲線和標準品，直接檢測樣品中核酸的原始濃度，比傳統熒光定量PCR的靈敏度和精確性更高。

1 數字PCR技術的基本原理

目前數字PCR主要分為3種：微孔式數字PCR、微滴式數字PCR和微腔式數字PCR。微孔式數字PCR是最早出現的數字PCR技術，在96或384孔聚丙烯板上完成；后來出現了微腔式數字PCR，采用了由多層軟刻蝕技術及聚二甲基硅材料制作成的系統；由于傳統的數字PCR技術取樣、操作復雜，成本較高；便衍生了微滴式數字PCR技術，微滴式數字PCR是目前相對成熟的數字PCR平臺，利用油包水乳化微滴顆粒作為反應器進行檢測。目前，數字PCR儀主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統和RainDance公司的RainDropTM dPCR系統。

目前，應用最廣泛的是微滴數字PCR，該技術具有靈敏度高、成本低的特點，可實現DNA的絕對定量。其工作原理是把DNA分子稀釋到一定濃度，生成一定數目的微滴，然后進行PCR擴增，讀取陽性微滴數目。再根據泊松分布計算出樣本中的DNA分子數[2-3]。相關文獻表明，與熒光定量PCR相比，數字PCR對核酸含量較低的樣品檢測準確率和靈敏度都較高[4-8]。

2 數字PCR的優勢

數字PCR技術是一種核酸分子絕對定量技術。它將熒光定量PCR反應體系分配到大量微小的反應器中，在每個微反應器中包含或不包含1個或多個拷貝的目標核酸分子（DNA模板），在反應器中進行“單分子模板PCR擴增”。擴增結束后，檢測陽性反應單元數目，利用統計學方法計算原始樣本中靶基因的拷貝數。

數字PCR不依賴對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。此外，由于數字PCR在判讀結果時，僅判斷“有/無”兩種擴增狀態，因此熒光信號與設定閾值線的交點對其無影響，不依賴于Ct值。所以，數字PCR的讀數結果受擴增效率的影響很低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高，數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大地降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度。因此，數字PCR技術特別適合檢測復雜背景中的稀有突變。

由于數字PCR具有靈敏度高、特異性好和精確性高的優點，它在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測、表達量微小差異鑒定和拷貝數變異檢測等方面表現出的優勢已被普遍認可，在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、單細胞基因表達和NGS測序文庫精確定量與結果驗證等諸多方面具有廣闊研究前景。Kalorama Information發布的研究報告顯示，到2019年全球數字PCR市場預計將達39.7億美元，中國是最主要的新興市場[9]。

3 數字PCR在微生物檢測領域的應用

核酸擴增技術是病原微生物檢測的一個重要方法，目前實驗室主要采用基于Taq Man探針法的熒光定量PCR體系對病原微生物（病毒、細菌、支原體等）進行核酸水平的檢測。雖然熒光定量PCR是目前病毒分子檢測方面的“金標準”，應用廣泛，但依賴于標準曲線的Ct值，而用于繪制標準曲線的標準品缺乏統一的計量標準。而數字PCR則不需要標準曲線，因此，被科研人員大量應用于病毒和致病菌的檢測研究中，如HBV[10-11]、腸病毒[12]、腺相關病毒[13]、巨細胞病毒[14]、單核細胞增生李斯特氏菌[15]、結核分支杄菌[16]、產志賀毒素大腸桿菌[17]、沙門氏菌[18]、大腸桿菌O157:H7[19]等。

4 結語

數字PCR與傳統熒光定量PCR相比具有獨特的技術優勢，實現了單分子DNA絕對定量，能夠精準分析出目標基因的濃度，目前已成為分子生物學研究中的重要工具。

雖然目前數字PCR檢測多處于發展初期，大多還處于實驗室的研發階段，沒有真正應用到微生物定量檢測中。但是，該方法具有簡單、快捷、靈敏、特異性強且綜合了熒光定量PCR的準確性及基因芯片的高通量特點，并且不依賴標準物質定量，有望成為核酸絕對定量的新標準。今后，應該將數字PCR法與現有的傳統微生物檢測方法相結合，制定微生物數字PCR檢測技術標準，提高樣品中病原菌的檢出率，并推廣應用，為微生物檢測提供技術支持。