綠色熒光蛋白轉基因大鼠脂肪間充質干細胞的培養及分化潛能鑒定

范友芬，潘艷艷，樂欣，晉國營，虞耀華

脂肪間充質干細胞（ADSCs）是一類來源于脂肪組織并具有多向分化潛能的干細胞，廣泛分布于各物種不同部位的脂肪組織中，具有骨髓間充質干細胞相似的表型和多向分化能力。ADSCs具有數量巨大、取材容易且獲取率高、體外擴增快、細胞老化率低及免疫原性低等特點[1]，還具有血管原性和抗炎活性，能促進組織新生血管形成[2]。這使得同種異體之間的ADSCs移植變為可行，且具有廣泛的臨床應用前景。劉相名等[3]從SD大鼠的脂肪組織中獲得了ADSCs，并向脂肪細胞、成骨細胞進行了誘導，體外可穩定表達外源基因，證明了其可作為自體移植的一種細胞來源和基因治療的一種載體。

綠色熒光蛋白（GFP）是在熒光示蹤技術中廣泛應用標記細胞的一種蛋白，具有高效、穩定、無細胞毒性及檢測方便等優點[4]。GFP轉基因大鼠可系統性表達GFP，可以利用光學成像技術跟蹤靶細胞，廣泛用于研究干細胞領域。本研究擬建立一種GFP轉基因大鼠ADSCs的分離、培養及純化的的方法，并對其細胞表型和多向分化潛能進行鑒定，以期為后續ADSCs應用于大鼠燒傷創面修復的研究提供基礎[5]。報道如下。

1　資料與方法

1.1材料 SPF級雌性GFP轉基因大鼠3只，4～5周齡；實驗級雌性SD大鼠3只，4周齡；均購于寧波大學實驗動物中心。FBS高糖DMEM全培、干細胞完全培養液、成脂誘導液A、成脂誘導液B及成骨誘導液，均為美國Thermo公司產品；PBS、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、抗大鼠CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE單抗、PE-IgG1、FITC-IgG1、茜素紅染色劑及油紅O染色劑等其他試劑，大連TaKaRa公司產品；流式細胞分析儀（貝克曼navios，美國）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠ADSCs的分離、培養 （1）ADSCs的分離：取GFP轉基因大鼠，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后行腹部、雙下肢消毒，無菌超凈工作臺內作腹部正中切口并向雙側腹股溝內側分離，取雙側脂肪組織并剝除血管組織，縫合切口；以無菌PBS沖洗取出的脂肪組織3次后，再用眼科剪將其剪碎至糊狀，裝入50 ml無菌離心管中。加入2～3倍體積的用PBS預配的1%Ⅱ型膠原酶，37℃振蕩消化30min，直至脂肪組織呈乳糜狀。離心沉淀5 min后小心取中層液體過200目細胞篩后，按1∶3比例加入10%FBS高糖DMEM全培終止反應，種于培養瓶內，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。（2）ADSCs的培養：ADSCs分離后第2天PBS沖洗，全量換液，10%FBS高糖DMEM全培培養，根據細胞生長情況，2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。待細胞生長至80%～90%融合時進行傳代。倒置熒光顯微鏡觀察第3代ADSCs的熒光強度衰減情況。

1.2.2大鼠ADSCs的細胞流式表型鑒定 取第3代的ADSCs，用胰蛋白酶進行消化，將其制備成單細胞懸液。1×106/ml細胞分別加入抗大鼠 CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE單抗各1l，PEIgG1、FITC-IgG1為陰性對照。4℃避光孵育30 min，以流式細胞分析儀檢測細胞表型。

1.2.3大鼠ADSCs向成骨細胞、成脂細胞誘導分化及鑒定 （1）成骨細胞誘導及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于6孔板中，每孔約3×103個細胞，按2ml/孔劑量加入干細胞完全培養液，放入溫度37℃、5%二氧化碳孵箱中培養，24 h后移去培養液，按2 ml/孔劑量加入成骨誘導液；每3天換液1次，如此誘導2～3周；待鈣結節形成。成骨誘導后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%異丙醇清洗，加入0.1%的茜素紅染色10min，用PBS沖洗，倒置光學顯微鏡下觀察并記錄。（2）成脂細胞誘導及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于6孔板中，每孔約2×104個細胞，按2 ml/孔劑量加入干細胞完全培養液，放入溫度37℃、5%二氧化碳孵箱中培養、每3天更換干細胞完全培養液，直至細胞達到100%融合。隨后移去培養液，按2ml/孔劑量加入成脂誘導液A開始誘導，3d后更換為成脂誘導液B維持，24h后再次更換為成脂誘導液A誘導，如此循環3次；當細胞內脂滴數量增多，但體積相對較小時，可用成脂誘導液B維持3～5d，至脂滴增大。成脂誘導后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%異丙醇清洗，加入2%油紅O染色10min，用PBS沖洗，倒置光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4傷口創面示蹤檢測 將SD大鼠按照文獻[6]方法制備大鼠皮膚深度燒傷模型，取ADSCs細胞懸液（濃度為1×106個/ml）多點注射于大鼠背部創面及創周皮下，在術后21 d時處死大鼠，常規消毒鋪單，沿大鼠背部創面范圍用無菌手術剪剪開皮膚，充分游離皮下后取下雙側創面皮膚組織，常規冷凍切片，熒光顯微鏡下觀察細胞定植情況。

2　結果

2.1ADSCs的分離與培養 成功完成大鼠ADSCs的分離、培養，采用酶消化法得到的ADSCs，1次傳代后在顯微鏡下觀察，細胞呈梭形細胞生長，原代及2代細胞還有少量血細胞混雜，到第3代則較前明顯純凈（封二彩圖1），細胞高度表達GFP（封二彩圖2）。3～10代內細胞基本按對數生長，形態均一。

2.2ADSCs的鑒定 取P3代ADSCs對其表面特異性標記物進行檢測，流式細胞儀鑒定示：所擴增ADSCs高表達間充質干細胞標記物CD29、CD90及CD105；對于造血干細胞表面標記物CD34、白細胞共同抗原CD45則呈現低表達，細胞表面標志物的表達與相關文獻報道基本一致（封二彩圖3）。

2.3ADSCs多向分化能力鑒定 經過21 d的成骨分化、成脂細胞分化實驗，實驗結果顯示：成骨誘導的細胞在茜素紅染色后出現了深色鈣結節，顯示為成骨細胞分化陽性（封二彩圖4）。成脂誘導的細胞在油紅O染色后，可見胞漿內有大小不一的橘黃色脂滴（封二彩圖5），顯示為成脂分化陽性。

2.4傷口創面示蹤檢測結果 將ADSCs細胞懸液多點注射于大鼠背部創面及創周皮下21 d后，創面冷凍切片熒光顯微鏡下可見散在點狀綠色熒光（封三彩圖1）。

3　討論

ADSCs作為生物成體間充質干細胞的一種，其具有多向分化潛能，如分化為脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、表皮、肝細胞、造血細胞以及神經元細胞等[6-7]。本實驗中分離培養出的GFT轉基因大鼠的ADSCs具有良好的分化能力，可向成脂、成骨分化。

據文獻報道，大鼠腹股溝處皮下脂肪墊是用于提取ADSCs最佳的取材部位，與背部、頸部、附睪、腸系膜及腹腔相比[8-9]，此處脂肪組織最為豐富，便于分離更多的ADSCs，只要盡可能剔除其中的血管和筋膜，避免過多的雜細胞混入就能提取出較純的ADSCs。本實驗在取材時選取GFT轉基因大鼠腹股溝處皮下脂肪墊。本實驗采用酶原消化并差速貼壁的方法成功分離培養ADSCs。因紅細胞有不貼壁的特性，待ADSCs貼壁后，便可以通過換液去除混雜的紅細胞的方法來替代裂解液的使用，這樣也避免了裂解液對ADSCs的損傷和影響[10]。同時通過換液和消化傳代可以去除漂浮的脂滴和雜細胞，使細胞得以純化。在培養過程中，見ADSCs呈長梭形、漩渦樣生長，傳代后細胞生長增殖速度快，連續傳至10代細胞形態均無明顯變化。

ADSCs具有間充質干細胞這一類細胞的特異性表面標記，表達大量的黏附分子，如持續表達CD9、整合素 1和4、細胞間黏附分子1、CD105、血管細胞黏附分子和活化淋巴細胞粘附分子，表達Ⅰ類組織相容性蛋白HLA-ABC，但ADSCs并不表達造血細胞表面標志如CD14、CD34或CD45，不表達Ⅱ類組織相容性抗原 HLA-DR及內皮細胞標志CD31，不表達共刺激因子B7-1、B7-2和CD40。ADSCs不表達MHC2Ⅱ類分子和B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，這樣會導致效應性T細胞無法激活，使輔助性T細胞無反應性而促成免疫耐受，從而表現出這一更為重要的生物學特性—低免疫原性，這就使同種異體ADSCs移植變為可能，從而擺脫了必須自體干細胞回植的局限，大大提高了實用性。本實驗中，流式細胞分析結果證明分離出的ADSCs表面標志物符合相關文獻報道[11]。

近年來，用于細胞標記示蹤的方法主要有熒光染料標記法、GFP標記法、核酸標記法及Y染色體標記法等[12]，各有優缺點。GFP是來自于南太平洋水母中的一種新型報告基因，具有特異性高、高效穩定、無細胞毒性、檢測方便等優點[4]，適于標記和示蹤細胞。GFP轉基因大鼠可系統性表達GFP。我國有研究者成功分離培養出了 GFP轉基因大鼠的骨髓間充質干細胞[4]、神經干細胞[13]及胚胎神經上皮干細胞[14]等，也有研究者采用GFP轉染法標記大鼠骨髓間充質干細胞[15]，均證明GFP標記細胞簡單易行，對細胞無毒性，具有良好的應用前景。但傳統的示蹤方法是在離體狀態下通過慢病毒或質粒轉染熒光染料來鑒定，且轉染效率難以控制，可能會對干細胞的增殖、分泌、分化功能有影響。GFP轉基因純合子大鼠的所有體細胞均能穩定表達綠色熒光，因此本實驗采用提取GFP轉基因大鼠的ADSCs，用于后續的燒傷創面修復的研究，對明確外源性ADSCs在其中的作用及機制具有重要意義。本實驗結果顯示，從GFP轉基因大鼠提取的ADSCs能穩定表達GFP，熒光顯微鏡下可見第3代細胞幾乎全部散發綠色熒光，細胞移植于燒傷創面后21 d，依然在皮膚創面切片上可見散狀綠色熒光，證明了示蹤效果好。

綜上所述，運用酶原消化并差速貼壁的方法可獲取純度高、生長增殖能力強和具有多向分化潛能的GFP-ADSCs，來源于GFP轉基因大鼠的ADSCs可高度穩定表達GFP，且簡單易行，活體移植，定植效果良好，可作為標記和示蹤大鼠脂肪間充質干細胞的蛋白。

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