低密度脂蛋白亞組分及分離檢測方法的研究進展*

孫浩行，汪 驊，王長城 綜述，李保國 審校

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海迪申生物技術有限公司研發部，上海 201201；3.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200025)

以低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高為特點的血脂異常是引起動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的重要危險因素[1]。目前，國際專家組和科學指南均聲明LDL-C為ASCVD的獨立危險因素，并將減少ASCVD發病率及病死率的治療方針專注于降低LDL-C上[2]。然而，部分研究發現，對ASCVD患者進行降脂治療后，ASCVD發病風險卻只減少了不到30%，部分患者LDL-C水平雖已降低至正常范圍仍會發生ASCVD[1-2]。可見，單從LDL-C定量評估ASCVD發病風險和病情嚴重存在局限性。近來，低密度脂蛋白(LDL)亞組分顆粒大小的變化引起了人們關注。LDL為多分子復合物，在物理特性上具有異質性，可分為一系列密度、體積和動力學行為各不同的亞組分，密度為1.006～1.063 g/mL[3]。LDL異質性會導致各亞組分膽固醇水平不同，如LDL亞型顆粒直徑減少3 nm，膽固醇減少約40%[4]。研究表明，LDL亞組分與ASCVD密切相關，同LDL-C相比，LDL亞組分能更好地評估ASCVD的發生和發展[2,5]。因此，ASCVD的臨床血脂檢測研究應注重LDL亞組分的檢測分析。本文就LDL亞組分的分型及其與ASCVD的關系和最新分離檢測方法等方面予以綜述。

1 LDL亞組分

1.1LDL亞組分的分型 LDL亞組分主要是依據顆粒直徑和密度進行分型。AUSTIN等[6]用梯度凝膠電泳根據顆粒直徑不同將LDL分為兩類：直徑≥25.5 nm的大而輕LDL(lbLDL)和直徑<25.5 nm的小而密LDL(sdLDL)。GEISS等[7]用密度梯度超速離心法(DGUC)根據密度不同將LDL分為7種亞型：LDL-1和LDL-2為lbLDL；LDL-3和LDL-4為中間密度LDL(ILDL)；LDL-5、LDL-6和LDL-7為sdLDL 。若進一步用DGUC分離sdLDL，可得到密度為1.044～1.060 g/mL的極小密度低密度脂蛋白(V-sdLDL)。同樣，有研究者采用3%預制聚丙烯酰胺管狀凝膠電泳(TGE)分離出7種LDL亞組分[8]。另外，有研究者用離子淌度法(IM)得到4種LDL亞型：LDL-Ⅰ、LDL-Ⅱ、LDL-Ⅲ和LDL-Ⅳ[9]；在此基礎上，KRAUSS等[10]用IM法進一步得到7種LDL亞組分：LDL-Ⅰ為lbLDL；LDL-Ⅱa和LDL-Ⅱb為ILDL；LDL-Ⅲa和LDL-Ⅲb為sdLDL；LDL-Ⅳa和LDL-Ⅳb為V-sdLDL。LDL亞組分的分型方法有很多，雖然由于方法學原理不同而導致各研究結果有所差異，但總體的分型一致。迄今，國際上并未有標準的LDL亞組分分型標準，以上幾種暫為目前研究領域常見分型。

1.2LDL亞組分與ASCVD 近年來，有研究表明，LDL亞組分不僅與ASCVD的發生和發展密切相關，并且比LDL-C能更好地評估ASCVD及相關疾病[10]。SHIFFMAN等[11]采用TGE法研究416例患者的LDL亞組分與心血管疾病(CVD)的關系，得出LDL-1和HDL均與CVD呈負相關，而LDL-3和LDL-6則與CVD呈正相關，并指出LDL亞組分顆粒間的變化是解釋LDL-C不能準確評估CVD的可能因素。此后，SRISAWASDI等[12]又研究了260例患者的LDL亞組分與代謝綜合征(MetS)的關系發現，LDL-C與MetS無顯著相關性，而回歸分析得到比值(LDL-3～LDL-6)/LDL-1與MetS有顯著相關性(P<0.001)，表明(LDL-3～LDL-6)/LDL-1可作為評估MetS患者血脂代謝狀態的優秀指標。

sdLDL作為LDL亞組分中密度大和體積較小的顆粒，由于其易于穿過動脈血管內壁，與LDL受體結合能力低，不易清除；在血漿中具有較長的半衰期、糖化易感性高、抗氧化性較低等特點，具有更強的致ASCVD潛在能力。諸多研究表明，sdLDL比LDL-C具有更重要的檢測意義。MELANDER等[5]用IM法分析了1 919例使用他汀類藥物未受益型CVD患者的LDL亞組分發現，隨著患者sdLDL增加，CVD發病率提高了2.3倍。與此類似的是，SHIFFMAN等[11]從馬爾默預防計劃參與者中隨機抽取1 784例CVD患者作為研究對象，在控制年齡、性別、高血壓、抽煙和糖尿病等傳統因素的影響后，發現LDL各亞組分都與CVD相關(P<0.001)；進一步控制LDL-C、HDL-C和TG因素后，sdLDL仍與CVD相關(P=0.03)。另外，MOGAREKAR等[13]在探究絕經后女性更易出現ASCVD原因時發現，絕經后女性體內sdLDL水平明顯增高，sdLDL與年齡、三酰甘油、總膽固醇和LDL-C等呈正相關，與HDL-C呈負相關，指出定量檢測sdLDL比單純檢測LDL-C更具臨床價值。

2 LDL亞組分分離檢測方法

2.1DGUC DGUC是根據LDL顆粒浮力密度的不同，經不同密度梯度鹽溶液超速離心后LDL各亞組分依次轉移至各密度區域。研究者可根據實際需求調整密度梯度，得到分型不同的亞組分。連續的DGUC可同時將脂蛋白各組分及亞組分分離，是分離LDL亞型的“黃金標準”方法，但所需血清樣品較多，分離時間長，耗資高。并且由于脂蛋白a[Lp(a)]密度和sdLDL密度存在交叉區，分離LDL亞組分易受Lp(a)的影響。DONG等[14]選擇1.044 g/mL作為lbLDL與sdLDL的分界點密度，在密度大于1.044 g/mL的分離溶液中加入巰基乙醇成功消除了Lp(a)的影響，得到兩種LDL亞型：lbLDL(1.006～1.044 g/mL)和sdLDL(1.044～1.063 g/mL)。另外，由垂直轉頭發展的VAP-Ⅱ密度梯度超速離心法能同時分離和定量檢測LDL亞組分。VAP-Ⅱ法是利用垂直轉頭密度梯度超速離心LDL后，經VAP-Ⅱ在線膽固醇檢測儀檢測后繪制出LDL亞組分的分布曲線，然后根據各曲線積分面積比例計算亞組分水平。同傳統超速離心相比，VAP-Ⅱ法將離心時間縮短至1 h，并擁有高分辨率的特點。WILLIAMS等[15]采用VAP-Ⅱ法得到4種LDL亞組分，發現LDL亞組分中sdLDL與CVD相關性最強，并且獨立于傳統血脂指標。

2.2梯度凝膠電泳法(GGE) GGE是采用從大到小梯度孔隙的凝膠對LDL亞組分進行分離，并根據所占總染色面積的比例計算出各組分水平。AUSTIN等[6]用2%～16%的非變性聚丙烯酰胺梯度凝膠將LDL分為A型和B型，而WILLIAMS等[15]用2%～14%的非變性聚丙烯酰胺梯度凝膠得到7種LDL亞組分。此外，Berkeley HeartlabTM分段梯度凝膠電泳系統(LDL-S3GGETM)也可將LDL分離為7種亞組分。LDL-S3GGETM是分離LDL亞組分已標準化的梯度凝膠電泳體系，適用于臨床診斷，但僅局限在Berkeley Heartlab實驗室。GGE為一般實驗室研究LDL亞組分常用方法，但分離時間在12 h之上。

2.3TGE Quantimetrix公司研發的LipoprintTM脂蛋白分析系統采用3%高分辨率線性TGE可將LDL分為7種亞組分。其原理是：血清與上樣膠溶液(含親脂染料蘇丹黑B，可與脂蛋白中的膽固醇酯結合)混合加于濃縮膠上，經30 min光聚合后，每管3 mA，電泳60 min，避光靜止30 min后在610 nm下進行光密度掃描。基于分子篩效應各亞型LDL分布在VLDL與HDL間，然后根據阻滯系數Rf值(RfVLDL=0，RfHDL=1)對LDL分型：Rf>0.40，sdLDL；Rf為0.38～0.40，ILDL；Rf<0.38，lbLDL。其中Rf值等于LDL亞組分與VLDL間距離/VLDL與HDL間距離的比值。LipoprintTM系統通過了美國FDA認證，可用于LDL臨床診斷，具有良好的應用前景。BANULS等[16]將LipoprintTM系統的TGE法同GGE法對比分析LDL亞組分發現，兩種方法在檢測lbLDL(145例)和sdLDL(32例)時一致性分別達到97.2%和81.3%。還有學者在LipoprintTM系統的基礎上做了優化，PATHAK等[17]根據質量設計方法發明一種分析LDL亞組分的高通量非變性TGE，采用3.15%分離膠可同時對40個樣品進行分析檢測，t檢測結果同LipoprintTM系統差異無統計學意義(P=0.05)，同時將每個樣品檢測的成本降低到2美元。

2.4毛細管電泳法(CE) 毛細管等速電泳(CITP)可以將分離后的LDL組分壓縮成窄小區帶，具有高分辨率的特點。MORENO-GORDALIZA等[18]發明一種分離LDL亞組分的新型CITP法，在pH為8.8～9.4的梯度下9.5 min內完成分析，得到6個LDL亞組分峰。此外，由傳統CE發展來的微芯片電泳技術實現了在刻蝕有微泳道的小型基片上分離檢測LDL亞組分。WANG等[3]在此系統上向樣品液中添加直徑5 nm、80 nmol/L的納米金提高了LDL亞組分間的分辨率。

2.5核磁共振法(NMR) NMR是根據LDL顆粒內核和外殼中脂類甲基團的質子磁共振信號檢測顆粒大小，利用甲基團信號不同區分各亞組分，以NMR甲基團振幅測定亞組分濃度。MATYUS等[19]采用了NMR法對LDL進行檢測分析，得到3種亞組分，批內、批間的精確度和重復試驗變異系數CV為2.6%～5.8%，結果符合臨床實驗室的常規檢測，可用于個人臨床診斷。NMR雖能快速全自動檢測LDL亞組分，但由于儀器特殊，難以在一般實驗室展開。

2.6IM IM原理是使用電噴射產生氣溶膠單電荷大粒子，然后經過不同的流動分析單元在大氣壓下根據離子淌度不同產生分離，隨后冷凝聚集各粒子，最后進行激光散射掃描檢測，將LDL顆粒直徑和數量轉化為各自的峰值和濃度。KRAUSS等[10]用IM分析了經兩種血漿膽固醇酯轉移蛋白抑制劑——默沙東和阿托伐他汀治療后患者體內的LDL亞組分，結果顯示雖然二者明顯減少了患者LDL組分數量，但阿托伐他汀不會降低LDL-Ⅳb水平，且默沙東會使患者LDL-Ⅳ水平增加，推測V-sdLDL可能是患者經降脂治療后仍出現ASCVD的關鍵因素。IM可直接對LDL亞組分顆粒大小和水平進行定量檢測，是近年用于分離檢測LDL亞組分的新方法，并且IM與DGUC、NMR和GGE等方法都具有良好的一致性[17]。

2.7其他檢測方法 除了以上方法，較常見的LDL亞組分檢測方法還有均相檢測法、動態光散射法和高效液相色譜法等。動態光散射法用兩種乳膠粒子溶液作為標準，以散射光的波動強度來檢測LDL亞組分，需要較高的專業技術，設備也昂貴。高效液相色譜法檢測LDL亞組分，需要對樣品進行超速離心預處理，檢測費時。DONG等[14]將HPLC和DGUC結合建立了一種新型同時檢測HDL和LDL亞組分的方法，準確度和靈敏度達到了臨床診斷的水平。近來有報道，用陰離子交換色譜法可將LDL分為5種亞組分：L1～L5，電負性依次升高，并推測與已氧化LDL顆粒類似的L5為主要的LDL，是致ASCVD的主要LDL亞組分[20]。

3 小 結

國內外對于ASCVD的防治指南都將降低LDL-C放在首位。然而在臨床治療中，LDL-C雖已降低，但ASCVD仍有發生。單純檢測LDL-C水平并不能全面評估ASCVD發病風險，應轉移至LDL的微觀結構上。大量研究都已證實，LDL亞型組分和ASCVD有直接的相關性，特別是sdLDL對ASCVD的危險評估優于其他常規血脂指標，這使LDL亞組分的分離檢測尤為重要。雖然已報道的LDL分析方法有很多，但能用于臨床自動化分析的很少。加快研究LDL亞組分分離檢測新方法，使其盡快走向臨床自動化分析尤為重要。而且，目前國際上并未有劃分LDL亞組分的統一標準，各分離檢測方法間也沒用統一的評價規則，導致采用各方法學研究LDL亞組分的結論有所差異。這在一定程度上阻礙了LDL檢測分析和LDL亞組分與ASCVD關系的研究。因此，未來需提高LDL亞組分的分離檢測方法，并制訂評價各方法的統一標準，盡快走向臨床自動化分析。另外，探究LDL亞組分與ASCVD發生和發展的機制也將會推動LDL亞組分的分離檢測和ASCVD的防控與治療。