血漿熱滅活處理在Nijmegen法檢測遺傳性凝血因子Ⅷ抑制物中的應用*

李 剛，劉 怡，吳潤暉，陳振萍

(兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點實驗室/教育部兒科重大疾病研究重點實驗室/首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心 100045)

血友病A(HA)是由于遺傳性凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致遺傳性出血性疾病。中、重型患者主要表現為自發關節出血，且大多在兒童期起病，治療仍以輸注血源性或基因重組FⅧ制劑為主[1]。獲得性FⅧ抑制物是目前最嚴重的并發癥，其導致替代治療無效、增加治療難度及費用、甚至增加出血風險[2]。既往報道HA患兒FⅧ抑制物的發生率為3.9%～30.0%，FⅧ抑制物監測是HA患兒臨床替代治療評估的關鍵[3-4]。因此，有必要選擇一種兼具靈敏度和特異度高的方法來檢測FⅧ抑制物滴度，以指導臨床早期識別和篩查，避免無效輸注，為及早調整治療方案贏得時機。目前Nijmegen-Bethesda法是檢測FⅧ抑制物滴度的金標準，國內開展FⅧ抑制物定量檢測的實驗室也多采用改良的Nijmegen法，但此方法依然有一定的局限性，如變異系數高及殘留內源性或外源性FⅧ的干擾，尤其是血漿中殘余FⅧ較多時，對抑制物滴度的計算存在一定影響。本研究通過對Nijmegen法增加待測血漿熱滅活處理過程，分析其對抑制物陽性或陰性患兒血漿的影響，以期進一步提高FⅧ抑制物檢測方法的特異度和靈敏度。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2017年7月于本院血友病門診接受診治的重型或中間型HA患兒52例。依據世界血友病聯盟推薦的HA嚴重程度分型標準進行分型[5]。同時選擇50例凝血功能正常患兒的血漿作為質控。

1.2儀器與試劑 所有檢測在ACL TOP500全自動凝血儀上進行，基于測定活化部分凝血活酶時間(APTT)的一期凝固法檢測FⅧ的活性(FⅧ:C)。乏FⅧ血漿、定標血漿、正常水平質控血漿及特殊水平質控血漿等試劑均購自美國IL公司。

1.3方法 抽取所有患兒靜脈血2.0 mL，3.2%枸櫞酸鈉抗凝，2 500 r/min離心15 min，分離待測血漿，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。血樣處理在1 h內完成。所有患兒均接受過外源性FⅧ輸注治療，且超過72 h洗脫期后進行檢測。

1.3.1正常混合血漿制備 50例凝血功能正常的患兒血漿經同上述方法采集標本混勻后加入固體咪唑，濃度達到0.1 mol/L，在4 ℃條件下，緩慢滴入濃度0.1 mol/L的鹽酸溶液至pH值為7.4，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2FⅧ抑制物滴度檢測 同一樣本分裝兩等份，分別采用Nijmegen法[6-7]及增加血漿熱滅活預處理的Nijmegen法平行檢測。

1.3.3血漿熱滅活預處理步驟 將患兒血漿在56 ℃水浴加熱30 min后離心取上清液后再行Nijmegen法檢測FⅧ抑制物。

1.3.4抑制物滴度 即受檢血漿滅活正常血漿中FⅧ的能力，以Bethesda單位(BU)來計算。1 BU：37 ℃孵育2 h后，中和外源性添加一個單位FⅧ的50%的抑制物量。抑制物滴度>5 BU為高滴度抑制物；≤5 BU為低滴度抑制物[8]；抑制物滴度<0.6 BU為陰性；≥0.6 BU為陽性。

1.4統計學處理 應用SPSS19.0軟件進行統計分析。計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；非正態分布的計量資料采用中位數和四分位數間距[M(P25,P75)]表示，組間比較采用秩和檢驗；對抑制物滴度水平的比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1一般情況 入組52例HA患兒，中位月齡為34(3，150)個月；重型39例(75.0%，FⅧ:C<1%)、中間型13例(25.0%，FⅧ:C為1%～5%)。52例患兒由原Nijmegen法檢測無抑制物病史24例(46.1%)；有抑制物病史28例(53.9%)。所有HA患兒均采用兩種方法進行FⅧ抑制物滴度檢測。

2.2兩種方法檢測抑制物的陽性率比較 對兩種方法檢測抑制物滴度的結果顯示，無熱滅活處理組中抑制物陰性24例，抑制物陽性28例，陽性率為42.3%。熱滅活預處理組中抑制物陰性者22例，抑制物陽性者30例，陽性率為57.6%。熱滅活處理組的陽性率略高于無熱處理組，但兩種檢測方法陽性率差異無統計學意義(P=0.205)。其中2例樣本在無熱滅活處理組中抑制物滴度均小于0.6 BU，而進行血漿熱滅活處理后抑制物滴度為0.6、0.7 BU。此樣本的血漿FⅧ:C為4.1%、4.5%。

2.3兩種方法檢測抑制物滴度水平比較 兩種方法檢測結果一致的22例陰性樣本及28例抑制物陽性樣本滴度值進行比較分析發現，在抑制物陰性組中，血漿熱滅活處理組抑制物滴度[0.37(0.17，0.48)BU]明顯高于無熱滅活處理組[0.12(0.02，0.34)BU]，差異有統計學意義(P<0.01)；在抑制物陽性組中，熱滅活處理組抑制物滴度為24.1(1.69，95.3)BU，無熱滅活處理組為24.8(1.77，105.29)BU，二者差異無統計學意義(P>0.05)，且兩種方法檢測的抑制物滴度水平之間呈明顯正相關(r=0.990 8，P<0.000 1)。

3 討 論

FⅧ抑制物屬于IgG型抗體，作為一種免疫球蛋白，可抑制FⅧ：C，其在體外及體內，均具有時間、溫度、pH值依賴性[9]。部分FⅧ抑制物可不表現抑制活性，而是通過與FⅧ抗原的結合形成免疫復合物，免疫復合物的清除縮短了FⅧ:C半衰期，從而影響療效。Bethesda法是FⅧ抑制物的定量檢測方法，其缺點是當抑制物水平較低時，這種方法對FⅧ抑制物檢測缺乏特異性。Nijmegen方法在Bethesda法基礎上進行了改進，對于檢測低滴度抗體特異性較好，已成為國際上推薦檢測抑制物的標準方法[6]。但如果血漿中殘余的FⅧ:C較高時，會影響抑制物檢測結果的準確性，且隨著小劑量預防治療的普及，抑制物陽性患者接受免疫耐受治療同時需監測FⅧ抑制物的滴度變化觀察療效，能夠定量檢測抑制物的大型醫療單位逐漸增多，如何準確快速檢測抑制物滴度是檢驗醫生需解決的問題。因個體間外源性凝血因子代謝差異，替代治療后洗脫時間不充分、乏FⅧ血漿中仍存在少量的FⅧ等原因均可導致檢測結果不準確。世界血友病聯盟推薦使用58 ℃下將待測血漿熱滅活90 min來消除血漿中殘余的FⅧ。王健琨等[10]通過改良Nijmegen方法，對待測血漿進行58 ℃水浴90 min預處理，其FⅧ抑制物檢出較原Nijmegen方法特異性更高。

針對凝血因子在56 ℃條件可完全失活而耐熱免疫球蛋白即抑制物仍能保持其生物活性這一特點，本研究對Nijmegen法增加56 ℃熱滅活30 min的預處理步驟，結果提示增加熱滅活處理的檢測結果可信。抑制物陰性樣本增加熱滅活過程后滴度水平明顯增高，且其中2例應用Nijmegen方法檢測為陰性的樣本采用熱滅活處理后其結果為陽性，其原因在于熱滅活環境下FⅧ與其他凝血因子同時被滅活，導致檢測體系中參與凝集反應蛋白水平降低，基于一期凝固法的APTT相應延長，提高了抑制物滴度檢測的靈敏度和特異度。DE LIMA MONTALVAO等[11]的研究結果也提示56 ℃下血漿滅活30 min可以提高血漿中含有殘余FⅧ抑制物檢測的靈敏度。比較兩種方法檢測抑制物滴度，結果顯示，差異無統計學意義(P>0.05)，主要是由于待測血漿中與FⅧ相抵抗的免疫球蛋白起主導作用，血漿中殘余的凝血因子可以忽略，且滅活前后耐熱蛋白并無消耗，在反應體系中仍發揮生物學效應，滴度水平無顯著差異。同時證明，Nijmegen方法增加血漿熱滅活預處理步驟對試驗結果無影響，不會出現假陰性結果，并且此方法較之前的58 ℃熱滅活90 min時間上明顯縮短。基于以上結果，建議對于HA患兒的血漿樣本可通過血漿糾正試驗對抑制物滴度進行初步預測，糾正試驗提示抑制物陽性且滿足3 d洗脫期的樣本不必滅活凝血因子可直接檢測[12]；抑制物陰性及取血前輸注凝血因子的樣本需增加熱滅活過程，提高抑制物檢測的靈敏度和特異度，避免假陰性。

隨著血友病預防治療開展，替代凝血因子產品使用量的增加，抑制物檢測的重要性得到了臨床醫生的廣泛認可。值得注意的是，Nijmegen方法檢測抑制物滴度建議待測血漿中FⅧ的水平要低于5%，如超過5%則需要通過人為補償待測混合樣本中FⅧ等方式予以糾正。輕型HA患兒自身含有一定量FⅧ，中、重型HA患兒輸注因子后未達到洗脫期時間體內仍殘存FⅧ。本研究增加凝血因子蛋白滅活過程可避免自身凝血因子干擾抑制物檢測。國內不同實驗室間的檢測結果仍存在較大的差異，其中部分原因可能是由于殘余的FⅧ對試驗結果的影響，增加56 ℃血漿滅活凝血因子過程操作步驟簡便，有望成為Nijmegen法抑制物檢測前期常規開展的必要步驟。