超高效液相色譜法快速測定煙草樣品中的植物色素

王晉 黃海濤 劉欣 許永 李晶 孔維松 張濤 張承明 楊光宇 李雪梅

摘要：建立超高效液相色譜法快速測定煙草中植物色素（新黃質、紫黃質、葉黃素、葉綠素-a、葉綠素-b、β-胡蘿卜素）檢測方法。90%丙酮超聲萃取30 min，色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-水梯度洗脫，以體積比按（乙腈90%+10%水），4.0 min（100%乙腈）的梯度條件，流速為0.8 mL/min，用二極管陣列檢測器檢測。6種色素在5 min內分離，檢測限15～22 ng/mL，平均回收率為93%～105%。采用自主設計的樣品萃取瓶進行前處理，前處理簡單快速，同時，色譜分離周期明顯縮短，與目前行業標準相比，樣品分析效率提高了4倍以上。

關鍵詞：超高效液相色譜;煙草;植物色素;快速測定

中圖分類號：O656.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0124-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.034? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Established a ultra performance liquid chromatography（UPLC） method for the rapid determination of plant pigments（neoxanthin，violaxanthin，lutein，chlorophyll-a，chlorophyll-b and β-carotene） in tobacco. The plant pigments were extracted from samples with 90% acetone by ultra-sonic extraction. Then，the plant pigments were separated by Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column， with and water mixture as mobile phase at a flow-rate of 0.8 mL/min. It eluted with gradient elution （90% V（acetonitrile））+10% V（water）） at the beginning，then the gradient elution replaced by acetonitrile 4 min later. These plant pigments were detected by diode array detector. Under the optimal conditions，6 kinds of plant pigments could be effectively separated within 5 min. The limits of detection（LODs） of 6 kinds of plant pigments were 15～22 ng/mL and the average recoveries were in the range of 93% to 105%. Via the self-designed sample extraction bottle using for pretreatment，and improved chromatography conditions，this method efficiency was enhanced 4 times than the current tobacco standard.

Key words： ultra performance liquid chromatography; tobacco; plant pigments; rapid determination

植物色素是煙草生長和利用太陽能進行光合作用的重要物質，同時也是影響煙草品質的重要成分，它們對煙葉的色澤和香味也有著重要影響[1-4]。在煙葉調制過程中，葉綠素類化合物的降解是評價煙葉調制好壞的重要指標，類胡蘿卜素是煙草中重要的香氣前體化合物，許多煙草特征香氣成分，如β-大馬酮、巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯等均是類胡蘿卜素降解產物[1-5]。因此，煙草中植物色素的準確測定對煙草質量評價具有重要的意義。煙草色素的測定通常采用分光光度法、近紅外光譜法和高效液相色譜法，其中分光光度法準確性較差，而近紅外光譜法只能進行1種半定量的預測[4-7]。傳統的液相色譜法由于分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、操作自動化，在煙草植物色素分析中得到了廣泛應用[6，7]。目前煙草行業標準YC/T 382-2010就采用高效液相色譜法測定煙草中的質體色素。

現有標準方法前處理和色譜分析時間長，對大量樣品進行快速化學分析評價，這些方法很難滿足需求。超高效液相色譜是2004年Waters公司推出了的新技術，該技術突破了傳統色譜分析的局限性，極大地提升了高效液相色譜的分析速度，近幾年來在國內得到了廣泛應用[6-8]。為了得到更簡便、快速的分析方法，對超高效液相色譜法測定煙草中植物色素進行了研究，每個樣品的色譜分析時間可縮短到5 min[5-7]。研究還通過自主設計的樣品萃取瓶，大大簡化了樣品前處理操作，使樣品前處理周期也大大縮短。改進方法和目前行業標準相比，日樣品分析量可提高4倍以上。該方法的建立為煙草樣品中的植物色素的檢測提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統，包括四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站。

水為石英亞沸蒸餾水，并用Milli-Q50超純水儀處理，電阻≥18 m？贅;乙腈和丙酮均為色譜純進口試劑（Fisher公司生產）;葉綠素-a、葉綠素-b、葉黃素、？茁-胡蘿卜素、新葉黃素和脫鎂葉綠素標準（Sigma公司和Fluka公司生產，含量>97%）。

改進的樣品萃取瓶見圖1，樣品萃取瓶由帶密封圈的外套管（圖1a）和帶0.45 μm過濾篩板的內套管（圖1b）組成。

1.2? 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;流動相為乙腈-水梯度洗脫，以體積比按0 min（乙腈90%+10%水），4.0 min （100%乙腈）的梯度條件，流速為 0.8 mL/min，進樣體積5.0 μL，柱溫30 ℃。葉黃素檢測波長為444.9 nm，β-胡蘿卜素檢測波長為452.1 nm，葉綠素-a檢測波長為649.5 nm，葉綠素-b檢測波長為664.2 nm，紫黃質檢測波長為441.2 nm，新葉黃素（新黃質）檢測波長為442.4 nm，脫鎂葉綠素測波長為445.4 nm。

1.3? 樣品處理

煙草樣品按YC/T 382-2010的方法制備，將樣品萃取瓶外套管（圖1a）置于不銹鋼試管架上，準確稱取樣品（新鮮煙葉0.2 g或烤煙1.0 g），加入外套管中，用25 mL的移液槍，往裝有樣品的套管中加入25 mL的90%丙酮，然后將萃取瓶的內套管卡在外套管的口部（圖1c）。裝好后將帶樣品瓶的試管架用恒溫超聲波水浴鍋超聲萃取35 min。萃取完后把萃取瓶的內套管向下壓，萃取溶液就通過過濾篩板進入到內套管中，并從內套管中的細彎管流出，到達樣品過濾的效果（圖1d）。從細彎管口收集萃取液，棄去最初的2～3 mL，然后用色譜進樣瓶直接收集1.0～1.5 mL的樣品萃取液，用于液相色譜分析。

2? 結果與分析

2.1? 樣品前處理

對于煙草中植物色素的測定，主要采用的是煙草行業標準YC/T 382-2010，即采用90%丙酮超聲萃取的方法進行檢測。因此，本試驗中參照行業標準，采用90%丙酮不同時間進行超聲萃取，結果表明，超聲萃取30 min，樣品中的色素可萃取完全。收集萃取過的殘渣再萃取一次，萃取液中已經沒有色素檢出。為了進一步減少樣品前處理環節，本研究中設計了如圖1所示的新樣品萃取瓶，該樣品萃取瓶由帶密封圈的外套管（圖1a）和帶0.45 μm過濾篩板的內套管（圖1b）組成。在樣品萃取瓶外套管（圖1a）中加入煙草樣品，然后再加入萃取溶劑（90%丙酮）。為了防止樣品萃取過程中萃取溶液濺出或超聲水浴鍋中的水濺入，將萃取瓶的內套管卡在外套管的口部（圖1c）。裝好后將樣品瓶放到電熱恒溫超聲波水浴鍋中超聲萃取。萃取完后將萃取瓶的內套管向下壓，萃取溶液通過過濾篩板進入到內套管中，從內套管中的細彎管流出，用色譜進樣瓶從細彎管口部收集流出的萃取溶液，直接可進行液相色譜分析。

整個樣品前處理過程中不需要樣品轉移就能得到過濾好的待分析樣品，前處理操作得到很大的簡化。操作過程中樣品前處理步驟的簡化，減少了有可能引入誤差的環節，分析結果的精密度也會相應的提高。另外，按常規方法樣品前處理操作時，用針頭過濾器過濾過程中，煙草細粉會堵塞過濾頭，過濾速度較慢;而在改進的處理方法中，超聲萃取完成后稍靜置，煙草樣品粉末就沉到底部，過濾時內套管中的篩板只與上層清夜接觸，這樣可有效地避免過濾過程中的篩板堵塞，過濾速度更快，操作更容易實現。

2.2? 色譜條件的選擇

植物色素通常采用甲醇-異丙醇、水-乙腈、水-四氫呋喃等體系。采用甲醇作為流動相時，？茁-胡蘿卜素峰型較差，此外，水-四氫呋喃和甲醇-異丙醇體系存在系統反壓高且毒性大的問題[6-10]。由于使用水-乙腈體系系統反壓小，所有待測成分均能達到基線分離，因此試驗選用水-乙腈體系。通過不同比例的水和乙腈作流動相 （包括梯度條件）等試驗條件的選擇，結果表明，按0 min（乙腈90%+10%水），4.0 min（100%乙腈），保持1.0 min，0.5 min回到起始梯度，平衡2.0 min后，繼續進下一個樣品的梯度條件，煙草樣品中的色素能達到完全分離且分離時間短，因此試驗選用該條件。為了獲得最佳靈敏度，采用二極管陣列檢測器，各待測成分均在其最大吸收波長下進行檢測，其檢測波長分別為葉黃素檢測波長444.9 nm，β-胡蘿卜素檢測波長452.1 nm，葉綠素-a檢測波長649.5 nm，葉綠素-b檢測波長664.2 nm， 紫黃質檢測波長441.2 nm，新黃質檢測波長442.4 nm。

在選定試驗條件下，標樣和實際樣品的色譜圖如圖2所示。由圖2可知，各待測組分均達到了基線分離，且色譜峰對稱性好，無明顯拖尾。另外，與目前的煙草行業標準相比，每個樣品色譜分離時間縮短了5倍。

2.3? 工作曲線

分別配制濃度為50、10、2.0、0.4、0.08 μg/mL的標準溶液，進樣后計算出不同濃度下的峰面積，計算出回歸方程，結果如表1所示。根據信噪比為S/N=3，測得各組分最低檢測濃度，其結果見表1。

2.4? 回收率試驗及精密度

回收率試驗，稱取相同樣品2份，其中一份為對照，另一份加入已知量的色素，通過加標樣品測出量減去未加標樣品測出量再除以標準加入量計算回收率，結果如表2所示。精密度試驗，準確取煙草樣品7份，在選定的色譜條件下平行測定7次，另取相同的煙草樣品7份，在不同天內測定，計算7次測定結果的相對標準偏差（RSD），結果見表2所示。

2.5? 樣品分析結果

按選定的樣品前處理條件和色譜條件測定了煙草樣品中的色素含量，結果見表3。

3? 結論

針對目前煙草行業標準分析周期長，較難滿足快速分析的需求。對快速液相色譜技術在煙草植物色素分析中的應用進行了研究。結果表明，煙草中的6種主要色素類化合物在5 min可完全得到分離。在0.5 min內回到起始梯度，保持2.0 min可達到平衡，繼續進下一個樣時保留時間無明顯波動，整個樣品色譜分離周期可縮短到7.5 min，與行業標準相比，效率提高5倍。研究還通過自主設計的樣品萃取瓶，大大簡化了樣品前處理操作，使樣品前處理周期也大大縮短。改進方法和目前行業標準相比，日樣品分析量可提高4倍以上。方法的精密度、回收率均可滿足煙草樣品分析的需求，通過實際樣品分析結果和行業標準方法進行對比，6種色素的分析結果均與煙草行業標準的測定結果相一致。該方法的建立為煙草中植物色素的分析提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。

參考文獻：

[1] 左天覺.煙草的生產、生理和生物化學[M].朱尊權，譯.第一版. 上海：上海遠東出版社，1993.

[2] 趙銘欽，劉金霞，劉國順，等.增施不同有機物質對烤煙質體色素及其降解產物的影響[J].浙江農業科學，2008，22（2）：243-246.

[3] 張槐苓，葛翠英，穆懷靜.煙草分析與檢驗[M].鄭州：河南科技出版社，1994.46-93.

[4] 田海英，韋鳳杰，張東豫，等.RP-HPLC法測定煙草中的質體色素[J].煙草科技，2009，49（4）：8-13.

[5] 施紅林，王保興，劉? 巍，等.固相萃取-高效液相色譜法測定煙草樣品中植物色素的研究[J].中國煙草學報，2003，9（2）：1-5.

[6] 甘賓賓，蔡? 卓，蔣世瓊，等.超高效液相色譜在現代分析檢驗中的應用進展[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（5）：955-957.

[7] 劉? 芳，楊? 柳，孫? 林，等.ASE-超高效液相色譜法快速測定煙草中的多酚類物質[J].中國煙草學報，2008，14（6）：1-5.

[8] 劉正聰，陸舍銘，劉春波，等.超高效液相色譜法測定環境香煙煙霧中植物葉中的煙堿和可替寧[J].化學工程師，2008，22（12）：43-45.

[9] 陳子雷，張? 紅，王文博，等.氣相色譜法測定高脂類食品中山梨酸、苯甲酸的含量[J].中國衛生檢驗雜志，2006，16（12）：1471-1473.

[10] BIRADAR S V，PATIL A R，SUDARSAN G V，et al. A comparative study of approaches used to improve solubility of roxithromycin[J].Powder Technology，2006，169（1）：22-27.