海綿共附生真菌ＦＷＺ０４１５代謝產(chǎn)物的研究

錢純果 周義權(quán) 楊曦亮 李奎 石麗橋

摘要：對海綿共附生真菌FWZ0415進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，并對其發(fā)酵培養(yǎng)物的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等方面的研究。運用常壓硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱（Sephadex LH-20）和半制備高效液相色譜（HPLC）等手段，從該菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)物的提取物中分離純化得到兩個化合物，并運用核磁共振1H NMR、13C NMR等手段鑒定這兩個化合物的結(jié)構(gòu)為violaceol-I和violaceol-II。測試這兩個化合物對腫瘤細(xì)胞系K252、MCF-7、SGC7901的細(xì)胞毒性，violaceol-I未見顯著的細(xì)胞毒性（IC50>30 μmol），violaceol-II對3株腫瘤細(xì)胞系的IC50分別為16.7、16.3、15.8 μmol。

關(guān)鍵詞：海綿共附生真菌;次生代謝產(chǎn)物;分離純化;結(jié)構(gòu)鑒定;抗腫瘤活性

中圖分類號：R284;R285? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0064-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.018? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Sponge epiphytic fungi FWZ0415 was cultured in solid state fermentation，and its secondary metabolites were isolated，purified and identified. Using silica gel column chromatography，Sephadex column（Sephadex LH-20） and the preparation of semi preparative high performance liquid chromatography（HPLC） methodtwo compounds were purified，and then identified as violaceol-I and violaceol-II by nuclear magnetic resonance 1H-NMR and 13C-NMR. The cytotoxicity of two compounds to K252，MCF-7 and SGC7901 were tested，violaceol-I was not significantly cytotoxicity（IC50>30 μmol）. The IC50 of violaceol-II to three tumor cell lines were 16.7，16.3，15.8 μmol，respectively.

Key words： spongye epiphytic fungi; secondary metabolites; isolation and purification; structural identification; antitumor activity

海綿是迄今為止最豐富的海洋天然產(chǎn)物的來源，已經(jīng)發(fā)展到1萬多種，占海洋動物種類的1/15。近年的研究表明，先前從海綿中提取得到的活性物質(zhì)，其真正的來源是海綿共生、寄生、附生的微生物[1]。海綿共附生微生物附著在海綿表面或者內(nèi)腔表面，隨意性比較大，會隨著海水的流動產(chǎn)生很大變化。而且海洋中特殊的高鹽、高壓、低溫、低光照的生存條件，也催生了一些與陸地微生物代謝方式不同的微生物[2]。研究海綿微生物并分離純化其次級代謝產(chǎn)物可作為開發(fā)海綿天然產(chǎn)物的重要途徑，并且為解決活性天然化合物藥源問題提供了可行方案[3]。

運用常壓硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱（Sephadex LH-20）和半制備高效液相色譜（HPLC）等手段，從海綿共附生真菌FWZ0415固體發(fā)酵培養(yǎng)物的提取物中分離純化得到了兩個化合物，鑒定其結(jié)構(gòu)，并考察兩個化合物對3株腫瘤細(xì)胞系K252、MCF-7、SGC7901的毒性。

1? 材料與方法

1.1? 菌種

菌株由中國科學(xué)院南海海洋研究所林秀萍實驗員從海綿樣品（編號為XWS04）分離得到，該樣品于2016年采自廣東省徐聞縣海域。菌種現(xiàn)保存在湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，菌種編號FWZ0415。

1.2? 儀器設(shè)備與試劑

核磁共振波譜儀Bruker AM-500 MHz;高效液相色譜儀為HITACHI公司的L-2130泵、L-2400檢測器的HPLC;循環(huán)水真空泵SHZ-CB型為鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品;硅膠（100-200目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品;葡聚糖凝膠Sephadex LH-20由Phamacia公司生產(chǎn);石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮（分析純）產(chǎn)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;氘代試劑DMSO是Carmbridage Isotope Laboratories公司產(chǎn)品。

1.3? 菌株FWZ0415 的固體發(fā)酵培養(yǎng)

將在MB（麥芽浸膏15 g，粗海鹽10 g，瓊脂粉15 g，去離子水1 000 mL，pH 7.4～7.8）上培養(yǎng)10 d的平板菌種選取長勢良好的部分，切下約0.5 cm×1.0 cm大小的培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)接至裝有MB液體種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將種子液轉(zhuǎn)接于大米固體培養(yǎng)基（大米200 g，粗海鹽2 g，自來水200 mL，裝于1 000 mL三角瓶）中，于25 ℃靜置培養(yǎng)。36 d后終止發(fā)酵，獲得42瓶培養(yǎng)物。

1.4? 菌株FWZ0415次級代謝物的提取

大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基用丙酮浸泡過夜，攪拌粉碎，超聲10 min。將提取物進(jìn)行抽濾，除去丙酮，水溶液用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層。大米固體發(fā)酵培養(yǎng)物殘渣用乙酸乙酯浸提3次，抽濾，收集乙酸乙酯濾液。合并乙酸乙酯溶液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾，獲得粗浸膏。用甲醇溶解粗浸膏，然后用石油醚萃取3次，將甲醇層回收，合并，蒸餾除去甲醇，最后共得到浸膏136.1 g。

1.5? 菌株FWZ0415次級代謝物的分離純化

將乙酸乙酯浸膏硅膠拌樣，裝柱。以石油醚-氯仿（1∶1）、氯仿-甲醇（1∶1）梯度洗脫總共得12個餾分。第10組分用甲醇溶解后，過葡聚糖凝膠柱，洗脫溶劑為甲醇，共得到8個餾分。將第4組分用55%水-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行HPLC半制備分離，流速3.0 mL/min，得到兩個單體化合物，化合物1和化合物2。

1.6? 化合物細(xì)胞毒性測試

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度，接種96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞在37 ℃、100%相對濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。用培養(yǎng)基將待測化合物稀釋至合適的作用濃度，按25 μL/孔加入細(xì)胞。細(xì)胞置于37 ℃、100%相對濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h。吸棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的新鮮完全培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～4 h。測定450 nm波長處的吸光度，以650 nm處吸光度作為參比，計算抑制率及IC50。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為淡黃色油狀物;硫酸香草醛顯紅色，分子式C14H14O5，結(jié)構(gòu)式見圖1。此化合物的波譜數(shù)據(jù)（表1）與文獻(xiàn)[4]中的已知化合物violaceol-I一致，化合物1鑒定為violaceol-I。

化合物2為淡黃色油狀物，硫酸香草醛顯紅色，分子式C14H14O5，結(jié)構(gòu)式見圖1。此化合物的波譜數(shù)據(jù)（表1）與文獻(xiàn)[4]中的已知化合物violaceol-II一致，化合物2鑒定為violaceol-II。

2.2? 細(xì)胞毒性

共培養(yǎng)72 h后，測試化合物1和化合物2對腫瘤細(xì)胞系K252、MCF-7、SGC7901的細(xì)胞毒性。結(jié)果（表2）表明，violaceol-I未見明顯的細(xì)胞毒性（IC50>30 μmol），violaceol-II對3株腫瘤細(xì)胞系的IC50分別為16.7、16.3、15.8 μmol。

3? 討論

目前，從海綿共附生微生物中分離出的不少結(jié)構(gòu)新穎的化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗蟲、抗炎等多種生物活性[5-8]。研究的海綿共附生真菌FWZ0415培養(yǎng)特征較特殊，其次級代謝產(chǎn)物非常豐富，因此對其進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物研究，得到兩個單體化合物，經(jīng)鑒定分別為violaceol-I、violaceol-II。這兩個化合物最早由Yamazaki等[9]于1981年從真菌Emericella violacea的代謝產(chǎn)物中分離得到，并具有微弱的抗菌活性。進(jìn)一步的研究表明，這類化合物對氧化磷酸化具有解偶聯(lián)作用，但是其作用會隨化合物的降解逐漸減弱消失[10]。Asami等[11]發(fā)現(xiàn)violaceol是激動蛋白的抑制劑，可以誘導(dǎo)呈纖維細(xì)胞形狀延伸，可能具有抗腫瘤活性。有文獻(xiàn)報道其對Aβ42有顯著的抗聚集活性[4]，IC50分別為5.1、2.3 μmol，該化合物可能可以用于阿爾茲海默癥的治療。在本試驗中，測試了化合物細(xì)胞毒性，化合物2顯示具有明顯的細(xì)胞毒性。在下一步的研究中，將測試其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

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