激素抵抗型腎病綜合征的基因診斷進(jìn)展

章萬(wàn)林，岑東

腎病綜合征（NS）是一種慢性腎?。–KD），主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低白蛋白血癥，伴有水腫、血脂升高。微小病變型腎病、系膜增生性腎炎、膜性腎?。∕N）、系膜毛細(xì)血管性腎炎和局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥（FSGS）是原發(fā)性NS（PNS）最為常見的臨床病理類型，MN好發(fā)于成人，其他好發(fā)于兒童和青少年。NS預(yù)后的個(gè)體差異大，病理類型、臨床因素及感染、血栓等并發(fā)癥是主要因素。糖皮質(zhì)激素（GC）仍是治療PNS的首選藥物，但對(duì)部分患者無效，兒童PNS約為20%，成人PNS約為40%。經(jīng)常規(guī)GC治療8周后不能得到臨床緩解或復(fù)發(fā)后再次使用無效的NS稱為激素抵抗型腎病綜合征（SRNS）。PNS病理類型是激素抵抗發(fā)生的主要關(guān)聯(lián)因素之一，以FSGS最為常見，其與GC療效的關(guān)系已被廣泛證實(shí)。目前認(rèn)為SRNS為一類單基因病，可耐受免疫抑制治療，且可快速進(jìn)展為終末期腎?。‥SKD）。隨著下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）的發(fā)展，對(duì)SRNS患者進(jìn)行基因檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化治療以取得最佳療效。本文就 SRNS基因診斷現(xiàn)況進(jìn)行總結(jié)，并探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 SRNS現(xiàn)況

根據(jù)患者對(duì)GC的治療反應(yīng)，將NS分為三類：激素敏感型、激素依賴型和SRNS。SRNS是臨床常見的腎病疑難病癥之一，其主要病理特點(diǎn)是存在局灶性節(jié)段性腎小球硬化。由于常規(guī)治療難以奏效，治療難度大，緩解率低，長(zhǎng)期大劑量激素使用并發(fā)癥多，屬難治性腎病綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可導(dǎo)致SRNS發(fā)生，如遺傳及免疫因素、合并感染、高凝、腎靜脈血栓，伴腎小管間質(zhì)損傷以及激素受體或耐藥基因表達(dá)異常等因素，因此明確診斷SRNS有助于避免或減少因采用激素和免疫抑制治療所帶來的損害。

在小于30歲人群中SRNS是導(dǎo)致CKD的第二大疾病，年發(fā)病率為2～4/百萬(wàn)，在成人與兒童NS中所占百分比分別是40%和20%。PNS是兒童時(shí)期泌尿系統(tǒng)的常見疾病，占兒童腎病綜合征的90%以上。大多數(shù)患兒對(duì)激素治療敏感，但仍有約20%PNS患兒為SRNS，其中，約30%SRNS患兒存在足細(xì)胞相關(guān)基因突變，主要表現(xiàn)為FSGS。SRNS患兒病情不易控制，容易發(fā)生NS并發(fā)癥，其中30%～40%SRNS患兒在10年內(nèi)發(fā)展為ESKD，腎移植后存在約33%復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

2 SRNS致病基因及異質(zhì)性

2.1 非系統(tǒng)性SRNS致病基因 先天性腎病綜合征（CNS）是指患兒出生后3個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)NS的臨床表現(xiàn)一類主要的非系統(tǒng)性SRNS。研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月齡早發(fā)非系統(tǒng)性SRNS患兒中70%～100%可以檢測(cè)到相關(guān)基因突變，其中以NPHS1、NPHS2、WT1、PLCE1最為常見。NPHS1是芬蘭型CNS的致病基因，此型特點(diǎn)為病情嚴(yán)重、大量蛋白尿和快速進(jìn)展至終末腎衰竭。NPHS2突變是嬰兒期（出生后4～12個(gè)月）與兒童期非系統(tǒng)性SRNS最常見的基因型，出現(xiàn)尿蛋白的時(shí)間相對(duì)較晚，平均發(fā)病年齡為6歲。6%散發(fā)SRNS患兒可檢測(cè)出WT1突變，但該突變也存在于系統(tǒng)性NS。PLCE1突變者表現(xiàn)為重型NS，早期發(fā)病并迅速進(jìn)展至終末期腎衰竭，病理改變有顯著異質(zhì)性，可見FSGS或DMS并存。

此外，經(jīng)常染色體遺傳的SRNS患者常常表現(xiàn)為遲發(fā)型，即在青春期或者成年期發(fā)病，且不同遺傳方式相關(guān)的致病基因也存在不同，常染色體顯性遺傳SRNS患者中存在ACTN4、ANLN、ARHGAP24、CD2AP、E2F3、INF2、PAX2、LMN和TRPC6，而常染色體隱性遺傳SRNS患者中發(fā)現(xiàn)ARHGDIA、CUBN、CFH、MYO1E、MAGI2、NEIL1、NPHS2、NUP93、NUP205和XPO5等基因突變存在。

2.2 系統(tǒng)性SRNS致病基因 系統(tǒng)性SRNS患者存在除腎臟以外的臨床癥狀，其相關(guān)突變包括編碼腎小球基底膜與黏附成分基因（LAMB2、ITGA3、ITGB4）、溶酶體（SCARB2）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架成分（MYH9）、線粒體基因（COQ2、COQ6、MTTL1、PDSS2、ADCK4）和核蛋白基因（WT1、SMARCL1、WDR73、LMX1B）。研究發(fā)現(xiàn)，LAMB2與LMX1B突變分別與Pierson綜合征、指甲髕骨綜合征相關(guān)，肌陣攣-腎衰竭綜合征與SCARB2相關(guān)，MYH9相關(guān)綜合征由MYH9突變導(dǎo)致，線粒體細(xì)胞病如MELAS是由MTTL1突變和輔酶Q10缺失（COQ2和COQ6突變）引起，PDSS2突變可引起亞急性壞死性腦脊髓病Alloway-Mowat綜合征與WDR73突變相關(guān)，而WT1突變者除腎臟病變外還可見泌尿生殖系統(tǒng)異常和惡性腫瘤等。

2.3 SRNS遺傳異質(zhì)性 研究發(fā)現(xiàn)，單基因性SRNS比例與早發(fā)年齡呈負(fù)相關(guān)，在SRNS患兒中相關(guān)致病基因的檢出率高于成年人，且其治療效果和預(yù)后更差，可能與繼發(fā)性SRNS在二個(gè)人群中的比重不同有關(guān)，但具體原因尚無相關(guān)報(bào)道。在家族性SRNS和出生2年內(nèi)發(fā)生的SRNS中可檢出的基因突變約95%；5歲以下的兒童中降至40%～60%；在年齡較大的散發(fā)性SRNS患兒中，基因突變的發(fā)生率約為20%。基因突變導(dǎo)致的SRNS較繼發(fā)性腎病進(jìn)展更迅速，而且對(duì)激素或其他免疫治療的有效率由40%～50%降至8%。

2.4 SRNS移植后復(fù)發(fā) 研究發(fā)現(xiàn)，在FSGS患者中腎移植后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為11%～50%，復(fù)發(fā)會(huì)再次導(dǎo)致終末腎衰竭。遺傳性SRNS患者腎移植后FSGS復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)低于非遺傳性FSGS患者。

3 SRNS基因診斷

3.1 主要基因檢測(cè)技術(shù) 基因檢測(cè)是基因診斷的技術(shù)基礎(chǔ)。隨著分子診斷的快速發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)眾多，可供根據(jù)不同檢測(cè)要求進(jìn)行選擇，而基因測(cè)序是檢測(cè)基因突變的主要手段之一，包括第一代測(cè)序技術(shù)（Sanger測(cè)序）和統(tǒng)稱為NGS的第二代、第三代等測(cè)序技術(shù)。NGS是一個(gè)技術(shù)群，基本原理為擴(kuò)增目標(biāo)DNA時(shí)，借助一些化學(xué)標(biāo)志物標(biāo)記的堿基插入DNA鏈時(shí)發(fā)出的信號(hào)來讀取序列信息，是一種利用克隆擴(kuò)增或單分子模板技術(shù)進(jìn)行的大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)，相對(duì)于第一代測(cè)序技術(shù)具有高通量、低成本和自動(dòng)化等特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)DNA片段行反復(fù)測(cè)序可達(dá)到很高的靈敏度和準(zhǔn)確度。目前，根據(jù)測(cè)序目的可分為目標(biāo)基因組測(cè)序、外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序等方式，廣泛應(yīng)用于腫瘤和遺傳性疾病診斷，對(duì)于屬單基因病的SNRS而言，其技術(shù)優(yōu)勢(shì)更為明顯。

3.2 已知的SRNS相關(guān)基因 隨著NGS快速應(yīng)用于臨床，已發(fā)現(xiàn)至少50個(gè)顯性或隱性遺傳基因與SRNS相關(guān)，根據(jù)病理機(jī)制不同，分為以下幾類：（1）濾過系膜相關(guān)蛋白：CD2AP、CRB2、FAT1、NPHS1、NPHS2、PLCE1、TRPC6；（2）肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架成分和膜蛋白相關(guān)基因：ARHGAP24、ARHGDIA、ACTN4、ANLN、APOL1、EMP2、CUBN、INF2、KANK1/2/4、MAGI2、MYH9、MYO1E、PODXL、PTPRO、SYNPO；（3）溶酶體基因：OCRL1、SCARB2；（4）腎小球基底膜與黏附成分基因：COL4A3/4/5、ITGA3、ITGB4、LAMB2；（5）線粒體基因：ADCK4、COQ2、COQ6、MTTL1、PDSS2；（6）代謝與胞漿蛋白相關(guān)基因：ALG1、CFH、DGKE、PMM2、TTC21B、ZMPSTE24；（7）核蛋白基因：WT1、E2F3、LMNA、NUP93、NUP107、NUP205、NXF5、PAX2、SMARCL1、WDR73、XPO5、LMX1B；（8）其他基因，如MYH9、APOL1。上述基因突變導(dǎo)致SRNS的相關(guān)報(bào)道日益增多，隨著NGS在臨床應(yīng)用的不斷推廣，更多SRNS相關(guān)基因突變將被發(fā)現(xiàn)。

3.3 適用基因檢測(cè)的NS人群 研究證實(shí)SRNS存在遺傳學(xué)基礎(chǔ)，即SRNS的發(fā)生與某些基因的突變相關(guān)，故對(duì)于NS陽(yáng)性家族史者建議行基因檢測(cè)，以確認(rèn)是否存在SRNS致病基因，從而做好監(jiān)測(cè)與預(yù)防，減少或推遲NS的發(fā)生。（1）先天早發(fā)型/芬蘭型CNS；（2）激素和免疫抑制治療無效的（抵抗強(qiáng)的松和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑）；（3）早發(fā)NS（年齡＜1歲）、兒童NS；（4）原發(fā)性FSGS或腎活檢DMS，或25歲前出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿的患者；（5）NS伴隨腎功能衰退或其他綜合征，如Denys-Drash綜合征、Frasier綜合征、Pierson綜合征、肌陣攣-腎衰竭綜合征、MYH9相關(guān)綜合征、Manibuloacral發(fā)育不良和Schimke免疫-骨發(fā)育不良等；（6）其他疑為SRNS者。

3.4 SRNS基因檢測(cè)的臨床意義

3.4.1 SRNS的確診 通過相關(guān)基因突變檢測(cè)可以確診SRNS致病基因，從而進(jìn)行個(gè)體化治療，避免不必要的激素治療帶來的嚴(yán)重副作用；明確SRNS的病因和分類，進(jìn)而有利于深入認(rèn)識(shí)和研究SRNS分子機(jī)制，指導(dǎo)SRNS臨床治療方案制定。

3.4.2 臨床治療的指導(dǎo) 不同SRNS由不同的致病基因?qū)е拢渲委煼桨敢膊煌?。輔酶Q10生物合成途徑的基因突變（COQ2、COQ6、ADCK4或PDSS2）導(dǎo)致的SRNS，可以嘗試用輔酶Q10來治療；ARHGDIA突變則可用鹽皮質(zhì)激素治療，CUBN突變可用B12治療。NPHS2純合或復(fù)合雜合突變 NS患兒對(duì)激素耐藥，若采用免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A將難以誘導(dǎo)完全緩解，且NPHS2突變的SRNS患兒腎移植術(shù)后FSGS復(fù)發(fā)率較無突變的SRNS患兒腎移植術(shù)后復(fù)發(fā)率低，故若SRNS患兒篩查出存在NPHS2突變，則應(yīng)避免采用激素或免疫抑制劑治療方案，還可為腎移植早做準(zhǔn)備。

3.4.3 疾病預(yù)后判斷與腎移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)SNRS相關(guān)基因檢測(cè)有助于疾病預(yù)后判斷。具有NPHS2突變的SRNS患兒從發(fā)病到進(jìn)入終末期腎功能衰竭的平均時(shí)間為7.4～9.6年。NPHS1突變（Fin major與Finminor）是芬蘭型CNS的致病基因，攜帶這兩種突變的患兒接受腎移植后 20%會(huì)產(chǎn)生抗nephrin抗體，再次出現(xiàn)大量蛋白尿，而NPHS2突變患者移植后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較低。攜帶 APOL1 G1/G2突變者患FSGS、高血壓腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加7～10倍，若為HIV腎病者，發(fā)生FSGS風(fēng)險(xiǎn)增加30倍；作為供者，腎移植易失敗，但作為受體則不影響移植效果，因此建議將APOL1納入腎移植前常規(guī)檢測(cè)。

3.4.4 產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢 基因檢測(cè)在臨床應(yīng)用對(duì)于兒童SRNS診治作用明顯。80%～100%的CNS患兒可明確相關(guān)的致病基因突變，即使在部分家族史缺失的情況下。34%～52%SNRS患者可檢出相關(guān)致病基因。因此，對(duì)兒童聯(lián)合檢測(cè)NPHS1、NPHS2、WT1、LAMB2、PLCE和INF2等基因，而對(duì)青少年或成人聯(lián)合檢測(cè)NPHS2、ACTN4和TRPC6等基因有助于CNS或SRNS的診斷與預(yù)測(cè)，對(duì)于攜帶相關(guān)基因的家族史者意義更為重大。

4 展望

4.1 NGS發(fā)展有助于SRNS新致病基因的發(fā)現(xiàn)NGS作為SRNS重要的分子檢測(cè)手段，處于不斷發(fā)展之中。第二代測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)通量顯著提高，是目前市場(chǎng)上主流的測(cè)序技術(shù)，但測(cè)序片段較短和需要模板是兩個(gè)主要的弊端所在。第三代測(cè)序技術(shù)基于單分子讀取技術(shù)，不需要PCR擴(kuò)增，具有巨大的應(yīng)用前景。第四代測(cè)序技術(shù)是一種不使用生物化學(xué)試劑直接讀取DNA序列信息的新型測(cè)序方法。理論上，NGS可對(duì)DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序，隨著NGS迅速發(fā)展及在臨床應(yīng)用的推廣，更多SRNS相關(guān)致病基因?qū)⒈话l(fā)現(xiàn)與證實(shí)，而相關(guān)RNA的發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)將是對(duì)現(xiàn)有致病基因檢測(cè)的有益補(bǔ)充。

4.2 臨床應(yīng)用的拓展 對(duì)SNRS患者進(jìn)行早期基因檢測(cè)可以預(yù)估疾病發(fā)展?；驒z測(cè)還可提供發(fā)病前、產(chǎn)前和胎胚植入前的遺傳學(xué)診斷?；蛲蛔兎治霾粌H可以篩查SRNS相關(guān)的突變基因，還可以追索突變基因的來源，如確認(rèn)父母攜帶突變基因與否，為高風(fēng)險(xiǎn)家庭提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。以NGS為代表的基因檢測(cè)技術(shù)在遺傳性疾病的診斷與鑒別診斷、發(fā)病機(jī)制研究、疾病監(jiān)測(cè)與預(yù)后評(píng)估等臨床價(jià)值已獲肯定，也為實(shí)施SNRS的個(gè)體化治療或精準(zhǔn)醫(yī)療提供了重要支撐。

(參考文獻(xiàn)略，讀者需要可向編輯部索取)