全人源單克隆抗體制備技術的研究進展

唐亞華綜述，胡慧明，朱美玲審校（南華大學附屬南華醫院：.藥學部；2.內分泌科，湖南衡陽42002）

1975年，KOHLER等[1]通過雜交瘤技術成功獲得了具有抗原特異性的鼠源性單克隆抗體，從而開啟了單克隆抗體開發的新紀元。單克隆抗體具有專一性高、親和力強等特點，已成為多種人類疾病診斷及治療的重要工具。然而，鼠源性抗體在臨床應用方面存在諸多缺陷。鼠源單抗應用至人體時，由于其來源于小鼠，具有免疫源性，會激活人體免疫系統，從而生成人抗鼠抗體，引發免疫損傷；鼠源單抗激活補體和Fc受體相關生物效應系統的特異性存在不足[2]。為了解決上述鼠源單抗存在的缺陷，科研工作者先后改造形成了嵌合型抗體和人源化抗體，但二者仍舊無法完全消除鼠源單抗的免疫源性，對臨床療效的改善依然有限[3]。為了進一步減少抗體的免疫原性，提高其臨床療效，研究者不斷探索制備全人源抗體的新方法。全人源抗體是指完全由人類抗體基因編碼而成的抗體，其免疫原性小、臨床效果好，是未來單克隆抗體的主要發展方向[4]。目前，制備全人源抗體主要有噬菌體抗體庫技術、轉基因小鼠技術及單個B細胞抗體制備技術。本文將對以上3種應用廣泛的全人源單克隆抗體制備技術做一簡要綜述。

1 噬菌體抗體庫技術

1990年MCCAFFERTY等[5]首次成功將抗體片段在噬菌體表面展示，經過20多年的發展，噬菌體抗體庫技術成為迄今最成熟、應用最廣泛的抗體庫技術之一。噬菌體抗體庫技術的基本原理是：應用聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增全套人抗體編碼基因序列，經酶切后將抗體DNA序列插入噬菌體編碼外殼蛋白結構基因的適當位置，建立噬菌體抗體文庫，使抗體與噬菌體外殼蛋白相融合，并以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面。將構建好的噬菌體抗體庫與目的抗原結合，通過抗原抗體特異性結合的原理，應用合適的篩選途徑，將不能與目的抗原相結合的噬菌體洗脫，篩選出能與目的抗原特異性結合的噬菌體。再通過對目的噬菌體DNA測序，得到抗原特異性的人抗體基因序列，最終利用基因工程技術制備特異性全人源抗體[6]。

目前，利用該技術已成功構建了多個不同類型的scFv、Fab和sdAb抗體庫并以此生產出多個應用于臨床的全人源單克隆抗體[7]。噬菌體抗體庫技術具有基因型和表型統一、篩選抗體周期短（最快只需1周）、篩選容量大等特點，理論上能夠分離得到幾乎所有抗原的特異性全人源抗體。然而，從噬菌體抗體庫獲得的抗體親和力普遍較低，難以用于臨床治療。近年來，科研工作者通過創新優化篩選過程、增加靶抗原多樣性等方法提高抗體的親和力；利用易錯PCR、DNA改組及基因深度測序等技術增加抗體庫的庫容和多樣性，為噬菌體全人源抗體的廣泛應用奠定了基礎。截至2014年，美國食品藥品監督管理局（FDA）總共批準了6個通過噬菌體抗體庫技術生產的抗體投入市場，同時還有30多種利用此技術生產的抗體藥物正處于各級臨床試驗階段[6]。

2 轉基因小鼠技術

1989年BRUGGEMANN等[8]首次將人IgH基因座轉入小鼠體內，引起基因重排并表達IgM，證明了利用轉基因小鼠制備人類抗體的可能性。隨后科學家通過酵母人工染色體技術以及基因敲除技術成功構建了全人源抗體轉基因小鼠，并將其公司化產業化，從而極大地推動了治療性抗體市場化的蓬勃發展。轉基因小鼠技術的基本原理是：應用相關基因工程技術破壞小鼠內源抗體基因，然后將人抗體基因轉入小鼠體內，再將目標抗原免疫轉基因小鼠，從而在其體內表達相應的抗體。該技術讓抗原抗體免疫反應在小鼠體內進行，因此，保證了抗體類別轉換的完整性、抗體克隆選擇的多樣性及抗體親和力成熟的自然機理，如發生骨髓的抗體基因重排、淋巴結生發中心抗原誘導體細胞高頻突變等，從而使通過該技術所得到的抗體具有良好的親和性、穩定性和可溶性等。

目前，人們已經研發出微基因座、人工染色體及轉染色體3代轉基因小鼠制備技術，并通過這3類轉基因小鼠成功生產出治療銀屑病、黑色素瘤、高膽固醇血癥等多種疾病的全人源單克隆抗體[9]。但是，由于人和小鼠之間免疫系統組成存在差異，如何通過轉基因小鼠獲得更接近人體天然產生的抗體結構，仍然是研究者追求的目標。

3 單個B細胞抗體制備技術

單個B細胞制備全人源抗體的基本原理是：從人外周血、骨髓等來源分選B細胞，將單個B細胞分至盛有適量細胞裂解液、RNA酶抑制劑的適當容器中，以此為模板進行反轉錄PCR擴增抗體基因序列。克隆至適當載體通過測序，分析評價插入、缺失和突變情況；再通過重疊延伸PCR方法將抗體基因片段連接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切將其連接至原核或真核載體內，在相應的系統中表達、純化得到全人源抗體，最終用目的抗原篩選和鑒定抗體的特異性、親和力等生物學特性。該技術保留了輕重鏈可變區的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、所需細胞量少等優勢[10]。但在實際應用過程中，B細胞分選技術和后續PCR基因擴增技術是制約單個B細胞抗體制備技術應用的重要因素。

根據研究目的不同，單個B細胞分選方式分為隨機分選和抗原特異性分選，樣本來源包括外周血、淋巴組織及骨髓。單個B細胞的隨機分選主要有顯微鏡挑選法[11]、激光捕獲顯微切割法[12]及熒光激活細胞分選法[13-14]。熒光激活細胞分選法以熒光劑和流式分選儀為基礎，能夠自動化分選單個B細胞，具有速度快、精確度高的優點，因此應用最為廣泛。抗原特異性單個B細胞分選方法主要包括抗原標記磁珠分選法[15]、多參數熒光標記細胞分選法[16-17]及微陣列芯片法[18-19]。微陣列芯片法是將芯片表面制作許多小孔，每個小孔中只能容納一個B細胞，隨后用熒光標記的目標抗原識別特異性抗體，進而將檢測到的能夠分泌目標抗原特異性抗體的B細胞從小孔內轉移至適當容器中進行后續操作。該技術具有高通量、效率高等優點，是目前分選單個B細胞技術中最先進、有效的方法之一。

由于抗體可變區基因序列的未知性，因此合理的引物序列在單個B細胞技術中至關重要，要求引物具有靈敏性、特異性，既能夠避免非特異性擴增又能夠有效地擴增出完整的抗體基因序列。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區不同前導序列設計前向引物混合物，反向引物特異性互補于抗體恒定區[10，20]。雖然基于混合引物的擴增方法已被證實能夠擴增出部分抗體序列，但在引物多樣性、擴增效率、特異性和抗體表達譜的還原等問題上仍需要改進[10]。OZAWA等[21]利用5'RACE技術，更加特異性地擴增出目的抗體可變區基因序列。此項技術在抗體基因多樣性方面相比于前向引物混合物PCR方法具有優勢，且此過程無須純化PCR產物、省略了復雜的前向引物混合物，大大簡化了反應體系[22-23]。

隨著基于單細胞的抗體制備技術的不斷開發和完善，通過該技術所產生的抗體具有全人源、高度抗原特異性和親和力高等優勢，單個B細胞抗體制備技術已逐漸成為單克隆抗體制備的主要技術[24]。但該技術還存在著諸如無法更高效地獲取特殊抗原特異性的B淋巴細胞，無法更準確地制備抗體結合的單抗表位，無法提高所得到抗體的作用寬度等局限性。相信隨著相關技術的優化和開發，單個B細胞抗體制備技術將得到進一步的發展和成熟，所制備的單克隆抗體也將在疾病的治療、預防等方面具有無限的應用前景。

4 全人源單克隆抗體展望分析

自1986年美國FDA批準第一個治療性單克隆進入臨床以來，治療性抗體發展迅速，截至2017年8月，FDA累計批準了69個治療性抗體藥物，其治療范圍包括腫瘤、免疫相關疾病（器官移植、自身免疫性疾病）及感染性疾病等，其中全人源單克隆抗體和人源化單克隆抗體已成主流[25-26]。雖然全人源單克隆抗體在保持親和力、中和性及減少免疫源性方面與人源化單克隆抗體相比取得了顯著成效，但由于人們對于抗體效應機制和機體免疫系統調節機制方面了解依然有限，全人源單克隆抗體的生產還存在著很多局限。隨著相關研究的深入和技術的發展，全人源單克隆抗體的生產必將更加豐富多樣，相關技術也將更加的先進和完善，越來越多的全人源單克隆抗體一定能夠在人類疾病診斷和治療領域發揮至關重要的作用。