揚州地區結核分枝桿菌對利福平與異煙肼耐藥基因突變位點分布特征分析*

曾方林，束玉鳳，王金富（揚州市第三人民醫院檢驗科，江蘇225000）

結核病為目前世界傳染病中病死率最高的一種傳染病。據WHO報告，全球1/3人群（約20億）感染了結核分枝桿菌，每年新發結核病例約900萬，且每年新增病例的5%為多重耐藥性結核菌株感染[1]。這些耐藥株比敏感株具有更高的病死率和發病率[2?3]。對全國范圍而言，利福平（RFP）與異煙肼（INH）雙重耐藥導致的耐多藥結核也成為難治性結核的主要因素。目前，絕對濃度法和比例法是檢測結核藥物敏感性的常規方法，但其具有耗時長（通常需要4～8周）、不易標準化等缺點，易延誤患者的治療，而基于羅氏固體培養法的結核耐藥診斷是最常用的檢測方法，但其周期長、操作煩瑣，也易耽誤患者的治療。隨著分子生物學技術的發展，基于聚合酶鏈反應（PCR）和分子探針雜交技術的藥敏試驗檢測方法得到廣泛應用，可用于快速篩查多重耐藥結核病患者。如能廣泛、快速地進行抗結核藥物的耐藥性檢測，對臨床早期合理用藥具有重要價值[4]。因此，本研究采用DNA?微陣列芯片法調查了揚州地區結核分枝桿菌（MTB）對RFP與INH耐藥基因突變位點的分布特征，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 選取2015年8月至2017年8月本院收治的結核患者痰涂片抗酸染色陽性且經PCR?熒光探針鑒定為MTB患者的標本、傳統結核培養鑒定為MTB的分離株標本、PCR?熒光探針法檢測鑒定為MTB且CT值小于30（Hu）的各類標本。

1.1.2 試劑 分枝桿菌核酸檢測試劑盒和MTB耐藥基因檢測試劑盒（博奧生物有限公司產品）。檢測指標包括RFP及INH的3個耐藥相關基因rpoB基因啟動子的野生型及不同突變型，其中RFP耐藥相關基因rpoB基因檢測6個位點，共13種突變型，含531位TCG→TTG、531位 TCG→TGG、526位 CAC→GAC、526位 CAC→TAC、526位 CAC→CTC、526位 CAC→CGC、511位 CTG→CCG、513位 CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG。INH耐藥相關基因katG基因、inhA基因各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因?15位C→T突變型。改良羅氏培養基為珠海貝索生物技術有限公司產品。

1.1.3 儀器 晶芯LuxScan10K?B微陣列芯片掃描儀、晶芯SlideWasher芯片洗干儀、晶芯BioMixer芯片雜交儀、晶芯Extractor36核酸快速提取儀均為北京博奧生物有限公司生產；Mx3000P實時熒光定量PCR儀為美國安捷倫Stratagene公司生產。

1.2 方法 嚴格按試劑說明書提取各標本核酸，然后進行分枝桿菌核酸檢測。對檢測CT值小于30（Hu）（共進行40次循環擴增）的核酸標本再按基因芯片法操作說明書進行PCR擴增、芯片雜交、洗滌甩干和掃描判讀。以芯片自帶的陰陽性對照作為質控，陽性對照點rpoB IC、katG IC、inhA IC應為陽性，陰性對照點為陰性則判斷實驗有效，否則判定該次實驗無效。

2 結 果

2.1 基本情況 去除重復檢測者共檢測369例，其中MTB陰性23例，MTB陽性346例。346例MTB陽性患者中耐RFP 48例（13.9%），耐INH 78例（22.5%），對二者同時耐藥33例（9.5%）。

2.2 RFP耐藥基因分布 48例RFP耐藥標本中RFPrpoB基因耐藥位點分布為531（TCG→TTG）位點24例（50.0%），526（CAC→TAC）位點 12 例（25.0%），526（CAC→CGC）位點 5例（10.4%），526（CAC→GAC）位點 1例（2.1%），511（CTG→CCG）位點 4例（8.3%），516（GAC→GTC）位點1例（2.1%），516（GAC→TAC）位點1例（2.1%）。

2.3 INH耐藥基因分布 78例INH耐藥標本中INH katG基因耐藥位點分布為315（AGC→ACC）位點54例（69.2%），315（AGC→AAC）位點5例（6.4%）；inhA基因耐藥位點分布為?15（C→T）位點 18例（23.1%），其中katG基因315位AGC→ACC聯合inhA基因?15位C→T突變1例（1.3%）。

3 討 論

RFP與INH作為最重要的一線抗結核藥物組合，檢測MTB對RFP與INH的敏感性對治療用藥具有重要價值。本研究使用MTB耐藥基因檢測試劑盒進行MTB對RFP與INH的耐藥性檢測，并在前期研究驗證過該方法具有良好的適用性[5]。該方法與傳統藥敏試驗檢測比較，具有檢測速度快、高通量、靈敏度高、易于標準化等優點，能很好地替代傳統藥敏檢測。針對目前揚州地區尚未規模化進行RFP與INH耐藥基因分布情況研究的現況，通過本研究以期了解揚州地區RFP與INH主要耐藥基因的分布特征，推動揚州地區對耐藥結核病的早期診斷水平，提高治療水平。

RFP主要作用于MTB DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位，干擾轉錄的開始及RNA延伸，發揮抑菌和殺菌作用[6]。95.0%對RFP耐藥菌株的突變發生在rpoB基因81 bp的熱點區域（編碼密碼子為507～533位）[7]。該區域被稱為RFP耐藥決定區（RRDR），85.0%耐藥菌株出現531位Ser、526位His和516位Asp基因變異。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533 位密碼子，結果顯示，揚州地區531、526突變位點為優勢突變位點，其中531位點占50.0%（24/48），526位點占 37.5%（18/48），最常見突變位點為531（TCG→TTG）突變位點（50.0%）和526（CAC→TAC）突變位點（25.0%），與相關研究結果相似[8?11]。

INH主要作用于細胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂類等成分[12]。在耐 INH的 MTB分離株中有 50%～70%katG基因發生突變[13]。inhA基因編碼的烯酰基還原酶是INH作用的靶點，與耐藥性密切相關，inhA基因突變導致INH耐藥的菌株達總耐藥株的25.0%[14]。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測katG基因的315位密碼子和inhA基因的?15位密碼子，結果顯示，揚州地區katG基因突變占主導地位[75.6%（59/78）]，inhA基因突變占次要地位（23.1%），其中 katG基因 315位 AGC→ACC聯合inhA基因?15位C→T突變1例（1.3%）。katG基因315（AGC→ACC）為主要突變位點（69.2%），inhA 基因?15（C→T）突變位點占 23.1%，與相關研究結果相似[8?11]。

另外，據相關文獻報道，最近在RFP耐藥菌株中的rpoB?RRDR發現了2個新的突變基因——Asp516Thr和Ser531Gly基因，以及在rpoB外也發現了一個突變基因——Ile572Phe基因[15]。此外，INH耐藥相關基因——katG和inhA基因雖然為主要突變基因，但有研究表明，由于katG和InhA操縱子的改變而導致MTB耐INH的分離株只占80.0%，還有20.0%耐INH分離株的這2個基因均無變化，可能還有其他耐藥機制的存在[16]。然而，MTB耐藥檢測試劑無法包含上述所有突變基因和突變形式，在檢測結果中有可能出現對RFP與INH實際上耐藥而檢測結果敏感的情況，因此，該方法檢測的RFP與INH的敏感性只能作為參考，并不能確診。但參考作者的前期研究，基因芯片法仍具有良好的靈敏度和特異性[5]，加之其速度快、高通量、靈敏度高、易于標準化等優點，也可作為當前該地區臨床MTB耐藥篩選的重要手段。

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