印度梨形孢發酵條件優化及玉米田間應用試驗

張玲秀， 白建華， 郝瑞林， 董社琴

(忻州師范學院生物系，山西忻州 034000)

隨著地球人口的不斷增加和人們對生活水平的不斷追求，人們對糧食產量的增加也提出了更高的要求，現在各國都在大力開發和實施綠色環保農業。玉米作為全球主要糧食和飼料作物之一，其產量的提高具有重要意義。

在4億年前，共生土壤真菌協助陸地植物在地球繁殖，兩者形成互利的關系。根部定殖真菌的共生對植物的適應、獲取營養和對生物和非生物的協迫具有重要作用。印度梨形孢(Pirifomosporaindica)被發現于印度西北部沙漠地區的灌木叢根部，主要由菌絲與孢子組成，其孢子形狀類似于梨形，根據其發現地與形態特征，將其命名為印度梨形孢。該菌屬于擔子菌門層菌綱梨形孢屬[1]。印度梨形孢可在植物根部定殖，并隨著根部的成熟，定殖量不斷增加。印度梨形孢在植物中的定殖過程包括3個階段：與植物之間相互識別開啟共生模式、定殖于植物進行活體營養階段、干擾植物細胞死亡程序形成共生關系。印度梨形孢與植物互作具有以下生物學功能：促進植物生長、提高植物抗逆境脅迫能力、提高植物抗生物逆境能力等[1]。

印度梨形孢是一種具有廣泛宿主的植物內生真菌[2]。它能促進植物的生長和提高產量，可提高植物對營養的吸收和對生物和非生物的脅迫，如抵抗干旱和水澇[3-4]。能夠誘發植物產生系統抗病性，顯著提高植物對多種病害的抗病性，減輕發病水平[5]，因而印度梨形孢定殖后能提高植株的系統抗病性和抗逆性。

印度梨形孢可在人工培養基上生長并能順利完成其生活史，這一性狀使其商品化開發應用成為可能，更具商業開發和產業化應用前景[6]。將印度梨形孢作為生物菌肥可以更好地為農業發展作貢獻，然而印度梨形孢發酵生產菌肥的工藝和菌肥田間應用試驗鮮有報道。

本研究首先對印度梨形孢進行發酵優化擴大培養菌肥，進而施用于大田玉米種子、3葉期、5葉期等時期，并對印度梨形孢定殖于玉米根部進行檢測，最后測定玉米生物總鮮質量、玉米產量，確定其對玉米生長量的影響。本研究能為印度梨形孢菌肥應用于大田玉米生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

印度梨形孢(Piriformosporaindica)保存于筆者所在實驗室。供試玉米品種為先玉335，種子購買于市場。

1.2 方法

1.2.1 響應面法優化設計 本試驗通過前期單因素優化結果，選取影響顯著的3個因素：A(初始pH值)、B(培養溫度)、C(轉速)，以印度梨形孢生物量(以D600 nm表示)為指標，根據Box-Behnken設計原理，設計響應面分析試驗，其因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

1.2.2 印度梨形孢共生玉米根形態學觀察及真菌18S rDNA擴增鑒定 在玉米生長的7葉期，隨機選取玉米根系，用自來水沖洗干凈后再用蒸餾水沖洗3遍，剪成1 cm長的小段，經10% NaOH浸泡4 h后洗凈，再經1% HCl浸泡5 min后洗凈，最后用0.05%乳酸石炭酸棉藍染色液染色制片，于體視顯微鏡下觀察印度梨形孢真菌定殖情況并拍照[7]。

另外，取玉米7葉期根系，用蒸餾水沖洗、乙醇消毒3遍后，采用十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethy ammonium bromide，簡稱CTAB法)提取總DNA，PCR擴增引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用Image Lab 3.0軟件進行分析。

1.2.3 印度梨形孢大田施肥及玉米生物量和產量的測定 農田選取地點為山西省忻州市定襄縣宏道鎮東街村，種植時間為2016年4月22日，種植數量為120株，分成3組：陽性對照、根部灌菌、種子拌菌+根部灌菌，每組40株，陰性對照不作處理，種子拌菌組在種植前將種子浸泡菌液；玉米在3葉期和5葉期進行2次根部澆灌稀釋菌液，收獲玉米后稱各區玉米總鮮質量、玉米棒質量，測量株高和葉長，并進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果與分析

2.1.1 Box-Behnken設計試驗結果 以pH值、溫度、轉速為自變量，以印度梨形孢菌液600 nm處的吸光度為響應指標，采用Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，試驗設計及實施結果見表2。

2.1.2 響應面設計結果及方差分析 根據表2的試驗結果，利用Design Expert v8.0.5.b軟件對試驗數據進行分析，所得主要分析結果見表3。

二次模型中回歸系數的顯著性檢驗結果(表3)表明，因素B(溫度)對印度梨形孢生物量影響效果的線性效應顯著，因素A(pH值)和C(轉速)效應不顯著；因素A2、B2、C2對結果的曲面效應顯著，因素AB、AC交互影響效應顯著。對試驗數據進行多次擬合回歸，以梨形孢生物量(Y)為因變量，初始pH值(A)、溫度(B)、轉速(C)為自變量建立回歸方程模型為Y=0.570-0.010A-0.046B-0.018C-0.060AB-0.051AC+0.038BC-0.082A2-0.130B2-0.072C2。

表2 印度梨形孢響應面試驗設計及結果

另外，由表3可知，試驗因素對印度梨形孢生物量影響顯著程度由大到小依次為溫度>轉速>初始pH值。模型的回歸F值為12.93，P=0.001 4，表明該模型在0.01水平上顯著。多元相關系數R2=0.983 2，調整R2=0.960 3，表明模型對試驗實際情況擬合較好，失擬項差異不顯著(P=0.227 7>0.05)，表示該方程試驗擬合效果好。

表3 回歸與方差分析結果

2.1.3 響應面圖及等高線圖分析 根據回歸方程得出不同因子的響應面和等高線，結果見圖1、圖2、圖3。響應面和等高線均可闡明該模型。在響應面中，單因素影響效果與曲面陡峭相關，曲面越陡峭，影響越顯著。等高線與響應面相對應，響應值越大曲線越接近中心。各因素交互作用與等高線形狀相關，圓形則為不顯著，橢圓為顯著。

通過Design Expert v8.0.5.b軟件進行分析，印度梨形孢生物量的最佳培養條件是初始pH值為6.02、培養溫度為27.55 ℃、轉速為178.2 r/min，此條件下菌體D600 nm的理論值為0.625 9。在該條件下進行3次試驗驗證，菌體D600 nm平均值為0.612 9，與預測值的誤差僅為2.07%，表明該模型可靠性高，應用響應面法優化印度梨形孢的培養條件是可行的。

2.2 印度梨形孢共生玉米根形態學觀察及真菌18S rDNA擴增鑒定

2.2.1 印度梨形孢共生玉米根形態學觀察結果 在玉米生長的7葉期，選取印度梨形孢真菌與玉米共生根系，經苔盼藍染色，在6.3×25體視顯微鏡下可清晰地觀察到該真菌在紫根部的細胞間和細胞內非常密集地定殖有橢圓形的厚垣孢子，主要在根系成熟區的表皮層，分生區、伸長區少有定殖。如圖4箭頭所示。

由圖4可知，印度梨形孢主要定殖在植物根系的表皮細胞，在細胞內或細胞間形成致密的菌絲組織。在定殖過程中，首先由附著在植物根部表皮的厚垣孢子萌發產生菌絲，緊接著萌發自不同孢子的菌絲迅速聯接起來，在根表形成菌絲網絡，孢子萌發后菌絲穿透根部表皮細胞壁或通過細胞間隙進入根組織內部。

2.2.2 通用引物ITS1和ITS4擴增結果 以提取的所有供試真菌DNA為模板，用通用引物ITS1和ITS4擴增的rDNA ITS，電泳圖譜顯示擴增出的片段大約380 bp，可確定的確有真菌存在于植物根系，另從分子大小初步判斷其為印度梨形孢浸染玉米根部。結果見圖5。

2.3 印度梨形孢大田施用及玉米生物量和產量的測定

印度梨形孢對供試玉米(先玉335)植株的生長有顯著性影響。玉米在生長各時期株高均顯著高于對照，接種印度梨形孢的玉米具有較長的主根，更綠、更寬的葉片，更粗壯的莖稈，更多量的生物總量和玉米產量。

由表4可知，從種子拌菌到3葉期和5葉期菌液澆灌，與對照相比，拌種加灌菌處理下，玉米生物量增加25%；玉米鮮質量增加38%； 3葉期平均主根長增加26%；株高增加9%；葉長增加17%。灌菌處理下，玉米生物量增加6%；玉米鮮質量增加18%；3葉期平均主根長增加15%；株高增加7%；葉長增加4%。可見印度梨形孢可顯著促進玉米的生長和提高產量，其中拌種加灌菌效果更明顯。印度梨形孢可伴隨玉米種子的萌發而定殖于根部，后期的根部澆灌也具有同樣的效果。施印度梨形孢菌肥宜在早期，促進效果更佳。

關于印度梨形孢促進玉米生長發育的機制可能涉及到激素和營養吸收等方面，另外對玉米干旱等逆境下所起的有益作用，也可能間接促進生物量和產量的增加，這方面有待進一步研究。

表4 印度梨形孢對大田玉米生物量、產量和主根長的影響

3 結論與討論

植物內生真菌印度梨形孢可進行離體培養，易于規?；苿┑闹苽?，寄主范圍更加廣泛，具有廣譜生物學效應特性。在生物功能上，印度梨形孢與叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi，簡稱AMF)極為相似，能促進植物生長，加快植物對氮、磷等礦物質的吸收，提高作物對逆境脅迫的忍耐性，誘導植物產生系統抗性。但AMF不能進行純培養，而印度梨形孢可以在人工培養基上進行純培養。自印度梨形孢被發現以來，關于該菌的寄主，該菌促進植物生長、提高植物抗逆抗病性、增加植物產量、提高果實品質等的研究報道層出不窮。近年來，廣大科研人員側重于印度梨形孢與植物互作分子機制的研究。這些研究主要來源于德國、印度等首次報道該菌的國家以及伊朗、墨西哥、美國等后來才逐漸開始研究該菌的國家。目前，國內浙江大學、福建農林大學的相關科研人員也在進行研究，但所做發酵優化并不全面，且未見將印度梨形孢開發制備成生物肥料和應用于玉米大田的研究報道[1，3，6]。

本研究在前期研究工作的基礎上，進一步采用響應面法優化印度梨形孢發酵技術參數為pH值6.02、培養溫度 27.55 ℃、轉速178.2 r/min。在此條件下，提高了菌體生物量，為印度梨形孢應用于大田實踐奠定了基礎。進一步可將印度梨形孢制備成綠色、安全、無污染的抗逆、促生型生物肥料，解決長期以來不合理施用化肥造成的土壤板結、環境污染等問題，彌補現有的各種生物肥料施用范圍局限、肥效不穩定等缺陷，為發展生態農業提供一條新途徑。