有機(jī)肥不同施肥量對(duì)茶園土壤微生物區(qū)系的影響

趙曉楠， 李玉紅， 蘆阿虔， 王 巖

(鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州 450001)

茶樹是多年生經(jīng)濟(jì)作物，喜酸聚鋁，因此茶園土壤比較特殊。為了提高茶葉產(chǎn)量，茶農(nóng)長期大量使用化肥，導(dǎo)致茶園土壤綜合肥力下降，茶園土壤生態(tài)遭到破壞。土壤是茶樹生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收的重要場(chǎng)所，是一個(gè)非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。施肥是影響土壤質(zhì)量及其可持續(xù)發(fā)展最重要的農(nóng)業(yè)措施之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，施肥技術(shù)在土壤肥力、土壤微生物及作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面具有非常重要的影響，而土壤微生物在促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解、土壤礦質(zhì)營養(yǎng)循環(huán)、維持和提高土壤肥力等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。20世紀(jì)90年代以來，關(guān)于不同施肥方式對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響已有多人進(jìn)行研究，但是前人對(duì)茶園土壤微生物的研究，受研究技術(shù)手段所限，大多數(shù)僅限于實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物，基于分子生物學(xué)的研究尚不多見。由于環(huán)境中的微生物只有1%可用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行分離培養(yǎng)[2-3]，勢(shì)必會(huì)低估土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，無法對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行全面精準(zhǔn)的分析。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于分子生物學(xué)的土壤微生物的研究方法，如高通量測(cè)序技術(shù)解決了微生物不可培養(yǎng)的問題，能夠準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落的豐度和多樣性。因此，研究不同施肥制度下茶園土壤微生物區(qū)系的特征，可為茶園合理施肥和營造良好的茶樹生長環(huán)境提供理論支撐。

河南省信陽市是歷史名茶信陽毛尖的產(chǎn)地，其茶葉種植面積較大，但在茶葉生產(chǎn)過程中同樣存在片面追求產(chǎn)量而忽視土壤質(zhì)量的問題。鑒于此，筆者在河南省信陽市浉河區(qū)浉河港鎮(zhèn)的茶園進(jìn)行大田試驗(yàn)，研究有機(jī)肥不同施用量對(duì)茶園土壤性質(zhì)和土壤微生物區(qū)系的影響，以期通過合理的施肥措施，實(shí)現(xiàn)信陽市茶產(chǎn)業(yè)生態(tài)、可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取位于河南省信陽市浉河區(qū)浉河港鎮(zhèn)林場(chǎng)村八里坡組的茶園進(jìn)行大田試驗(yàn)，供試茶園的生境狀況如下：茶樹品種為福建大白茶7號(hào)，樹齡為16年，地理位置為32.026°N、113.849°E，面積為0.5 hm2，海拔為284.3 m，坡向?yàn)闁|坡，坡度為25°，前作為林地。分別于2012年12月、2013年12月和2014年12月進(jìn)行有機(jī)肥表面撒施，茶園按當(dāng)?shù)亓?xí)慣進(jìn)行田間管理，于每年清明節(jié)前采取土壤樣品進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理：不施肥(CK)、施有機(jī)肥1 500 kg/hm2(T1)和施有機(jī)肥3 000 kg/hm2(T2)。試驗(yàn)用有機(jī)肥養(yǎng)分含量標(biāo)準(zhǔn)：有機(jī)質(zhì)>45%，N+P2O5+K2O>7%。

1.2 樣品采集

連續(xù)施用有機(jī)肥3年后，采用五點(diǎn)取樣法對(duì)各處理試驗(yàn)田進(jìn)行土壤樣品采集。取0～20 cm土層的土壤，剔除土樣中較大的根和石子等雜物，之后將土樣中較大的土塊捏碎，混合均勻，然后采用四分法，將一部分裝入15 mL離心管中冷藏，用于土壤微生物分析；另一部分于托盤中自然風(fēng)干后磨細(xì)，過18、80目篩，用于土壤養(yǎng)分含量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分含量測(cè)定方法 土壤pH值的測(cè)定采用SPM-10數(shù)字式pH計(jì)測(cè)定，堿解氮含量的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，土壤速效磷含量的測(cè)定采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法，土壤速效鉀含量的測(cè)定采用乙酸銨提取-火焰光度法，土壤有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定采用重鉻酸鉀-油浴法[4]。

1.3.2 土壤微生物區(qū)系測(cè)定 土壤微生物區(qū)系采用高通量測(cè)序技術(shù)[5-6]，細(xì)菌以16S rDNA作為標(biāo)記基因，真菌以18S rDNA作為標(biāo)記基因，測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)茶園土壤養(yǎng)分含量的影響

從表1可以看出，施用有機(jī)肥可以提高土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和速效鉀含量，對(duì)土壤pH值和速效磷含量的影響不大。

表1 供試茶園的土壤養(yǎng)分含量

2.2 不同處理對(duì)茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組分的影響

2.2.1 不同處理對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分的影響 從圖1中不同處理茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分分析結(jié)果可以看出，不同處理茶園土壤所含細(xì)菌屬的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化。從對(duì)照土樣中共檢測(cè)出441個(gè)細(xì)菌屬，總數(shù)是14 944個(gè)；從T1處理土樣中共檢測(cè)到493個(gè)細(xì)菌屬，總數(shù)是8 529個(gè)；從T2處理土樣中共檢測(cè)到535個(gè)細(xì)菌屬，總數(shù)是9 672個(gè)。隨著有機(jī)肥施用量的增加，檢測(cè)出的細(xì)菌屬的種類增加。

在檢測(cè)出的所有細(xì)菌屬中，除去未檢測(cè)到的和未命名的，將各處理細(xì)菌屬含量排名前10的列出。由表2可知，不同處理的茶園土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的種類和數(shù)量均有差異，其中數(shù)量達(dá)到總數(shù)2%以上的細(xì)菌屬，對(duì)照有6種，分別為Gp1、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、Gp3、Gp6、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和生絲微菌屬(Rhizomicrobium)；T1處理中數(shù)量達(dá)到總數(shù)2%以上的有10個(gè)屬，分別為沙雷氏菌屬(Serratia)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、食酸菌屬(Acidovorax)、綠膿桿菌(Pseudomonas)、發(fā)光細(xì)菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)、戴爾福特菌屬(Delftia)、Gp4、鐵桿菌屬(Ferruginibacter)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)；T2處理土壤中數(shù)量達(dá)到總數(shù)2%以上的有7個(gè)屬，分別為假單胞菌屬(Pseudomonas)、Gp4、Gp1、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、發(fā)光細(xì)菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 不同處理土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬含量及占比

由表2還可以看出，不同處理茶園土壤優(yōu)勢(shì)菌屬種類及其占比均發(fā)生了變化。與對(duì)照相比，施用有機(jī)肥數(shù)量增加的細(xì)菌有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、發(fā)光菌屬和黃色桿菌屬等。其中，乳酸桿菌屬于厭氧性微生物，關(guān)于乳酸桿菌的應(yīng)用在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)上已有很多人進(jìn)行研究[7-8]，但是其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用研究很少。發(fā)光細(xì)菌是一種在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見熒光的細(xì)菌，發(fā)光細(xì)菌及其發(fā)光基因在環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可以用來檢測(cè)土壤毒性[9-11]。黃色桿菌屬對(duì)農(nóng)田中的對(duì)鱗翅目害蟲有很好的防治作用，可用來殺死菜青蟲[12]。至于茶園土壤中這些細(xì)菌的功能和作用到底是什么尚不得而知，須要進(jìn)一步探討與研究。

2.2.2 不同處理對(duì)茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組分的影響 從圖2的不同處理對(duì)茶園土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)組分的影響可以看出，不同施肥處理的茶園土壤所含真菌屬的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化，其中從對(duì)照中檢測(cè)出47個(gè)真菌屬，總數(shù)是5 687個(gè)；從T1處理中檢測(cè)到64個(gè)真菌屬，總數(shù)是86 112個(gè)；從T2處理檢測(cè)到70個(gè)真菌屬，總數(shù)是11 736個(gè)。

在檢測(cè)出的所有真菌屬中，除去未檢測(cè)到的和未命名的，將各處理真菌屬數(shù)量排名前10的列出，由表3可以看出，占比達(dá)到2%以上的真菌屬數(shù)量作為優(yōu)勢(shì)菌屬，對(duì)照中優(yōu)勢(shì)真菌屬有4種，分別為粗糙孔菌屬(Trechispora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)；T1處理有8種，分別為接合菌綱未命名屬(unclassified Zygomycota)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)、原金蝗屬(Gongronella)、糙孢孔目-未命名屬(unclassified Trechisporales)、紅酵母(Rhodotorula)和Umbelopsis；T2處理有8種，分別為隱球菌屬(Cryptococcus)、糙孢孔目未命名屬(Unclassified Trechisporales)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紅酵母(Rhodotorula)、皮司霉屬(Guehomyces)、Adisciso、被孢霉屬(Mortierella)和Mrakia。

從表3還可看出，不同處理下茶園土壤的優(yōu)勢(shì)真菌屬種類及其占比均發(fā)生了變化。與對(duì)照相比，施用有機(jī)肥后數(shù)量增加的真菌主要有鐮刀菌屬、隱球菌屬和被孢霉屬等，從T1、T2處理中均檢測(cè)到了紅酵母。有研究表明，鐮刀菌屬廣泛分布于自然界中，能產(chǎn)生植物刺激素(赤霉素)，可使農(nóng)作物增產(chǎn)，同時(shí)也是一類重要的植物病原菌，能引起許多植物病害，如由禾谷鐮刀菌為病原的小麥赤霉病是寧夏小麥的常發(fā)性病害[13]；然而，鐮刀菌在植物線蟲防治方面卻有重要作用，而且非致病性鐮刀菌還可用來防治鐮刀菌病害。壺菌門是高等植物的寄生蟲，雖然對(duì)植物生長的直接影響不大，但是其游動(dòng)孢子是傳播土壤中一些病毒的介體，研究發(fā)現(xiàn)，壺菌門的玉蜀黍節(jié)壺菌能引起玉米褐斑病，內(nèi)生集壺菌能引起馬鈴薯癌腫病，因此，該菌的減少有助于土壤環(huán)境的改善。紅酵母是一種腐生菌，可分解多種物質(zhì)，是天然的清潔工[14]。然而，這些茶園土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌到底有什么樣的功能尚不清楚，如何篩選出具有促生型或抗病型功能的有益菌值得進(jìn)一步研究。

表3 不同處理優(yōu)勢(shì)真菌屬含量及其占比

2.3 不同處理對(duì)茶園土壤生物多樣性的影響

α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，計(jì)算群落分布豐度(community richness)的指數(shù)有Chao指數(shù)、ACE指數(shù)，這2個(gè)指數(shù)用來估計(jì)群落中OTU(操作分類單元)數(shù)。用Shannon指數(shù)來計(jì)算群落分布多樣性(community diversity)，Shannon值越大，說明群落的多樣性越高。用各樣品文庫的覆蓋率可以反映測(cè)序結(jié)果的真實(shí)情況。

由表4不同處理對(duì)茶園土壤細(xì)菌多樣性的影響結(jié)果可知，在97%分類水平下，不同施肥處理下微生物OTU數(shù)量、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)有所差異。Chao指數(shù)的大小順序?yàn)門2>CK>T1；ACE指數(shù)的大小順序?yàn)門2>CK>T1；Shannon指數(shù)的大小順序?yàn)镃K>T2>T1。由此可見，施用有機(jī)肥可提高茶園土壤細(xì)菌的豐度，但并未提高細(xì)菌群落的多樣性。

由不同施肥處理對(duì)茶園土壤真菌多樣性的影響(表5)可知，Chao指數(shù)表現(xiàn)為T2>CK>T1，ACE指數(shù)表現(xiàn)為T2>CK>T1，Shannon指數(shù)表現(xiàn)為T2>T1>CK。以上結(jié)果表明，有機(jī)肥的施入并不一定會(huì)提高真菌的豐度，但對(duì)于豐富土壤真菌的多樣性是有利的。

3 討論與結(jié)論

目前，高通量測(cè)序方法已經(jīng)成為研究不同地區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成的主要方法。劉洋等分析了基于454高通量測(cè)序的黃土高原不同喬木林土壤細(xì)菌群落特征，結(jié)果表明，

表4 不同處理對(duì)茶園土壤細(xì)菌多樣性的影響

表5 不同處理對(duì)茶園土壤真菌多樣性的影響

不同喬木林土壤中的優(yōu)勢(shì)菌來自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)，主要優(yōu)勢(shì)菌綱為放線桿菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacte ria)、酸桿菌(Acidobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteo bacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)[15]。汪其同等基于高通量測(cè)序分析了楊樹人工林根際和非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的不同，發(fā)現(xiàn)根際和非根際相對(duì)豐度>4%的屬有8個(gè)，分別是Acidobacterium、Gp1、Acidobacterium、Gp3、Acidobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Bradyrhizobium、Burkholderia、Streptomyces和AcidobacteriumGp4[16]。α多樣性分析表明，根際土壤細(xì)菌群落多樣性高于非根際土壤，但差異未達(dá)到顯著水平。

施用有機(jī)肥對(duì)土壤微生物的影響已有很多研究，朱慶松等分析了不同覆蓋措施對(duì)信陽毛尖茶園土壤微生物量動(dòng)態(tài)變化的影響，結(jié)果表明，稻草覆蓋處理與白三葉覆蓋處理均能增加土壤微生物的數(shù)量和活性[17]。朱海平等通過分析不同培肥管理措施對(duì)土壤微生物生態(tài)特征的影響發(fā)現(xiàn)，施入廄肥、化肥或秸桿還田均能明顯增加土壤微生物生物量及呼吸量[18]。林新堅(jiān)等研究表明，施用有機(jī)肥可有效改善土壤物理性狀，增加土壤微生物總量[19]。王鵬研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)生物活性肥料能夠促進(jìn)土壤中有益微生物的繁衍，有效提高土壤酶生物活性[20]。單武雄等發(fā)現(xiàn)，施用菜籽餅肥加稻草覆蓋處理可以顯著提高0～20 cm土層的蚯蚓數(shù)量和生物量、氨氧化細(xì)菌、好氣性自生固氮菌、嫌氣性自生固氮菌、放線菌、真菌和細(xì)菌等物生物數(shù)量[21]。溫延臣等研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥以及有機(jī)無機(jī)配肥與化肥相比，土壤微生物碳、氮含量分別增加50%～112%、34%～79%，提高了土壤活性養(yǎng)分供應(yīng)能力[22]。總體來說，施用有機(jī)肥可以增加土壤中微生物的數(shù)量，但是目前基于高通量測(cè)序的方法對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的研究尚不多見。

因此，本試驗(yàn)運(yùn)用Miseq測(cè)序平臺(tái)研究了有機(jī)肥施用量對(duì)茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的影響，結(jié)果表明，增施有機(jī)肥可以改變茶園土壤微生物的OTU數(shù)量和種類，且隨著施肥量增加，茶園土壤微生物的OTU豐度越高。不同施肥處理的茶園土壤所含微生物屬的種類和數(shù)量都有所差異，隨著有機(jī)肥施用量的加大，可檢測(cè)出的細(xì)菌和真菌屬的種類也變多。